【技術領域】【0001】 本發明係有關於一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物及其製備方式，以及該機能性萃取物之用途。
【先前技術】【0002】 按，據衛福部健保數於民國107年所公布的疾病費用統計，全台急性慢性腎病患者共消耗健保費用約503億元，在我國國病排行上持續保持最高消費的疾病排行，其中，洗腎病患的費用年消費即佔433億元，除創歷年新高外，健保署統計國人洗腎人數亦以突破8.7萬人。隨著國人近年飲食西化，高醣、高油及高鹽份的飲食習慣，加上高壓的生活環境，越來越多的國人罹患糖尿病、高血壓、高血脂等三高慢性疾病，並且患病年齡有逐年下降之趨勢，並且前述的慢性病會進一步的對腎臟造成負擔，逐步的破壞腎臟的機能。
【0003】 在我國長年洗腎的病患中，糖尿病患者即佔了洗腎病患約40%之強，係造成腎病的重要因素之一。因此，透過防治糖尿病患者慢性腎病變的發生，包括如何降低腎病患者尿素氮的形成，如何過有效的控制患者的飲食，使用低蛋白膳食的方式及適度的補充基礎胺基酸或酮酸(Ketoac ids)以維持患者正常的腎臟生理功能，係目前針對糖尿病慢性腎病變患者的症狀緩解的重要課題。
【0004】 糖尿病會導致廣泛的腎臟變異，是以糖尿病腎病變(Diabetic Nephropathy，DN)屬於終末期腎臟功能衰竭的主要原因，然而，目前該疾病發生的機轉及詳細細節尚待更進一步的研究闡明。也因此目前急需建立合適的DN疾病動物模式，進而探討DN的發病作用機制，及開發新型的治療策略，雖然目前尚未有動物模型可以概括的模擬人類DN的所有表現特徵，但以鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)或合併高脂質誘導的糖尿病C57BL/6J小鼠腎病變，是可供研究人員研究其分子標靶或作用途徑且適用於臨床轉譯學上的良好DN模式。根據相關文獻指出，糖尿病腎病變的疾病動物模式(主要為大鼠、小鼠的實驗動物)的分子標靶及訊息路徑，其症狀係有腎小球過濾增加、氧化壓力提高、晚期醣基化終端產物的積累、蛋白激酶C(Protein kinase C)及轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的過度表現等現象。再者，抗發炎反應也已經被證實可改善糖尿病性腎病實驗動物的腎臟損傷，因此，探討糖尿病腎病過程中細胞黏附分子、趨化因子和發炎性細胞因子的表達，也可以作為研究糖尿病腎病變動物模型的治療標靶之指標。
【0005】 糖尿病腎病變在發病的過程中，病情隨著時間加重後，最終產生了大量的蛋白尿，進而激活了近端腎小管上皮細胞(proximal tubular epithelial cell，PTEC)產生了間質性發炎，包括高葡萄糖本身及晚期醣基化終端產物(AGEs)和其羰基中間體也會激活許多信息傳導路徑的調控機制，如NF-κB、蛋白激酶C、細胞外調節蛋白激酶ERK1/2、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 MAPKs)、AP-1轉錄因子(Activator Protein-1，AP-1)等因子的高度活化和活性氧的產生。
【0006】 另外，於梗阻型腎病小鼠模型中發現，蘇拉明(Suramin，拜耳)可大幅的抑制TGF-β1、α-SMA和I型膠原蛋白的表達，同時減少胞外基質的沉澱，進而降低白細胞的間質浸潤及阻斷表皮細胞生長因數(Epidermal Growth Factor，EGF)和血小板衍生生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)受體的磷酸化，最終達到改善腎纖維化的效果。也因此，TGF-β信號傳導的活化被認為係直接促進纖維細胞活化和纖維化進程的主要機制，TGF-β1可透過激活Smad2/3蛋白質的作用，誘導腎臟細胞(包括腎絲球/腎小管細胞)分化成纖維細胞，而腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β)IL-1β及細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecules-1，ICAM-1)等發炎促進因子和單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemoattrac tant Protein-1，MCP-1，CCL2)亦可以造成腎臟組織的纖維化加劇。
【0007】 同時，前人的文獻指出，在流行病學的研究中，有不少的報導證實了胰島素抗性與腎臟功能不全之間的關聯性，在改善胰島性阻抗(Insulin resistance)後，在尿白蛋白/總蛋白質的排泄比例之間發現了正向的關聯性，顯示了兩者之間具有一定的因果關係。
【0008】 糖尿病腎病變病患因為腎功能等代謝問題需要限制飲食種類，為了控制血糖、血脂、血壓、尿蛋白能接近正常值，需攝取比正常人更少的蛋白、油、鹽、糖、脂肪(膽固醇)，配合適量的膳食纖維、水分攝取、規律運動等，但也可能會因限制過嚴或者腎臟病惡化而產生厭食，進而造成熱量攝取不足，引起身體組織蛋白質的分解，產生過多的含氮廢物。蛋白質-能量損耗(Protein-energy wasting，PEW)也是慢性腎病變(Chronic kidney disease,CKD)病人死亡之潛在危險因子之一，因此腎病患者需攝取足夠的熱量，才得以能維持正氮平衡，也是避免病人產生營養不良的關鍵。而臨床上為了延緩尿毒症患者走向末期腎臟疾病的時程，會被建議以低蛋白飲食控制腎臟功能的衰竭病徵。所謂的低蛋白飲食，可以分為兩類：傳統低蛋白飲食(Low Protein Diet，LPD)與補充性非常低蛋白飲食(Supplement-ed Very Low Protein Diet，SLPD)，而低蛋白飲食的作用在於減少尿中蛋白含量、減緩腎功能衰退的速度與減緩尿毒症狀及徵候(Uremic symptoms and signs)等。低蛋白飲食可以延緩慢性腎病晚期腎功能衰退，包括糖尿病腎病，這作用主要是LPD可會限制入球小動脈(interlobular artery)、減少腎小球濾過率(GFR)來降低腎小球內的壓力，進而改善腎小球肥大(透過抑制TGF-β訊息路徑)達到預防與延緩DKD的發作。此外有研究指出，VLPD可透過減少哺乳動物mTORC1的表現來恢復自噬作用，從而改善了腎小管-間質的損傷，炎症和纖維化。使用低蛋白飲食治療之病患可以適時補充必需氨基酸-吉多利(Ketosteril，α酮酸-胺基酸)，此種胺基酸組合能有效降低體內含氮廢物的產生。吉多利的結構為酮基類似物(Keto analogues)，可利用轉胺作用(Transamination)將非必需胺基酸的氨(NH3)和吉多利結構中的酮基做取代，使氨(NH3)能在整個循環中被再次利用。臨床上針對慢性腎衰竭患者攝食低蛋白配方產品中發現，受試者接受低蛋白飲食之後，患者的體重由62.4公斤明顯的增加至63.1公斤，身體質量指數也由24.6公斤/公尺2明顯的增加至24.8公斤/公尺2，顯示患者的營養狀況良好，且患者的血清白蛋白、前白蛋白、運鐵蛋白以及血紅素皆有明顯的上升，顯示患者的營養狀況有獲得良好改善。
【0009】 目前市面上常見的幾款針對低蛋白飲食的配方多以麥芽糊精、濃縮乳清蛋白、高單元葵花油等配方作為腎臟病之補充品應用。人體內約有一萬多種胜肽，各式胜肽主要經由胃蛋白酶和胰蛋白酶來消化水解一般食物中的蛋白質(亦可利用自體合成)，不同的胜肽鏈組成可能造就不同功能性胜肽，進而幫助人體維持機能平衡與營養補充。近年來已有研究指出，部分胜肽的吸收率比胺基酸大，比胺基酸更易、更快被機體吸收利用，如某些具有特殊生理活性的小(短)肽能夠參與機體生理活動和代謝調節。
【0010】 是以根據上述因素，發明人擬開發出一種可緩解糖尿病性腎病變的保健原料，能兼顧低蛋白高營養的機能性營養配方劑，利用我國四面環海的地理位置所富含的藻類資源，結合位於適中緯度所有的環境溫度優勢，搭配生物醫學以及新農業的養殖技術，針對據潛力的藻類進行開發。
【發明內容】【0011】 小球藻(Chlorella sp.)是具有高蛋白質含量(佔乾藻重40-70%)與特殊活性多醣的食用微藻，由於其多樣的生物活性，長久以來被用作營養補充品或機能性食品。有關小球藻在改善糖尿病與腎病變已有相當多的研究，當肥胖ob/ob小鼠攝取蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)粉末或熱水提取物(多醣)，其血清總膽固醇水平顯著減少、胰島素濃度提升與脂聯素濃度增加，並可增加葡萄糖和胰島素的耐受性。以小球藻蛋白質替代傳統豌豆蛋白所製成的牛肉餅(beef patties)，可顯著增加了牛肉餅中所有胺基酸的濃度，特別是谷胺酸，賴胺酸和天冬胺酸是主要的氨基酸，同時也不減原牛肉餅中的營養含量和味道特徵。
【0012】 另一方面，蛋白胜肽(Peptide)是人體最重要的營養素，由必需胺基酸結合而成的天然物質，植物或動物來源的蛋白胜肽具有抗菌、抗氧化、抗高血壓和免疫調節活性。那些超出其營養價值的生物學功能的肽稱為生物活性肽，通常長度為2-20個胺基酸殘基，但也可以由20個胺基酸殘基以上所組成。研究指出，大豆蛋白經純化後，透過模擬胃腸消化後會產生具有抗癌及抗炎活性，並由實驗結果發現，在5kDa以下成分相較於10kDa以上成分有較顯著降低酯多醣(LPS)引起的發炎反應作用。相關研究亦指出，β-伴大豆球蛋白(大豆中主要儲存蛋白之一)可通過增加胰島素敏感性來降低血糖及抑制血管緊張素轉換酶(ACE)來降低血壓，進而延緩糖尿病腎病的惡化。此外，相關研究亦證實，小球藻蛋白經特定酵素水解後可篩選出具有生物活性的胜肽，一含有十一個胺基酸的單一胜肽，胺基酸序列為Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe，該十一胜肽具有pH值穩定性、熱穩定性及腸胃酵素耐受性。細胞體外試驗亦顯示，該十一胜肽能夠有效的清除各種自由基，包括氫氧自由基、超氧自由基、過氧化自由基、DPPH自由基以及ABTS自由基；其清除自由基的效果較人工合成之抗氧化劑BHT、維生素E、維生素C和其它從海洋蛋白質來源所分離的胜肽為佳。
【0013】 因此，為了找尋出一種可緩解糖尿病性腎病變的保健原料，並兼顧低蛋白高營養的機能性要求，同時利用藻類豐富之其他營養成分，本發明提供一種由小球藻萃取出之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物，該萃取物可自小球藻以水萃取出之成分，經胰蛋白酶水解後分離出之一種多醣萃取物。
【0014】 在本發明的一實施例中，該多醣萃取物係可抑制巨噬細胞白细胞介素-1β(IL-1β)或/與腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表現量。
【0015】 在本發明的一實施例中，該多醣萃取物之分子量係小於3kDa。
【0016】 在本發明的一實施例中，該多醣萃取物之分子量係小於1kDa。
【0017】 在本發明前述實施例中，該多醣萃取物係可抑制腎小管細胞的正常T細胞表達和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTEs)表現量。
【0018】 在本發明前述實施例中，該多醣萃取物可進一步抑制腎絲球細胞的單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)表現量。
【0019】 在本發明的另一實施例中，提供一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物，該萃取物係自小球藻以熱水萃取出之成分，經胃蛋白酶水解後分離出之一種胜肽萃取物，該胜肽萃取物分子量係約小於3kDa，並可抑制腎小管細胞的正常T細胞表達和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTEs)表現量。
【0020】 在本發明的一實施例中，該胜肽萃取物分子量係小於1kDa。
【0021】 在本發明的一實施例中，該胜肽萃取物分子量係介於約1~3kDa之間。
【0022】 在本發明的一實施例中，該多醣萃取物係可抑制腎絲球細胞的單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)表現量。
【0023】 藉由本發明實施例之試驗結果顯示，在細胞存活率分析(MTT)試驗中，多醣萃取液及胜肽萃取液皆並未發現有對細胞的顯著毒性，同時針對慢性腎病變的相關分子生物學試驗中也可觀察到特定分子量的PS及PP組別，對抑制相關生化指標的因子有著顯著性的降低效果，顯示小球藻機能性萃取物在開發可緩解糖尿病性腎病變的保健原料，同時能兼顧低蛋白高營養的機能性營養配方劑上，具有高度開發的潛力。
【圖式簡單說明】【0049】 圖1為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經萃取後分別以多醣萃取組(PS)及蛋白萃取組(PP)根據不同分子量的分組(<3kDa PS 3-10kDa PS及>10kDa PS)與不同分子量(<1kDa PP 1-3kDa PP及>3kDa PP)對巨噬細胞RAW264.7進行細胞存活率分析(MTT)之結果圖。
【0050】 圖2為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經萃取後分別以多醣萃取組(PS)及蛋白萃取組(PP)根據不同分子量的分組(<3kDa PS 3-10kDa PS及>10kDa PS)與不同分子量(<1kDa PP 1-3kDa PP及>3kDa PP)對腎小管細胞LLC-PK1進行細胞存活率分析(MTT)之結果圖。
【0051】 圖3為為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經萃取後分別以多醣萃取組(PS)及蛋白萃取組(PP)根據不同分子量的分組(<3kDa PS 3-10kDa PS及>10kDa PS)與不同分子量(<1kDa PP 1-3kDa PP及>3kDa PP)對腎絲球細胞RMC進行細胞存活率分析(MTT)之結果圖。
【0052】 圖4為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物對測定使用LPS誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa、1-3kDa PP)共培養48小時後，巨噬細胞RAW264.7的IL-1β(A)表現量結果圖。
【0053】 圖5為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物對測定使用LPS誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa、1-3kDa PP)共培養48小時後，巨噬細胞RAW264.7的TNF-α(B)表現量結果圖。
【0054】 圖6為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物對測定使用STZ誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa、1-3kDa PP)共培養48小時後，腎小管細胞LLC-PK1細胞的RANTEs(C)表現量結果圖。
【0055】 圖7為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物對測定使用ACEs誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa、1-3kDa PP)共培養48小時後，腎絲球RMC細胞的MCP-1表現量結果圖。
【0056】 圖8為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物對STZ誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa、1-3kDa PP)共培養48小時後，腎小管細胞LLC-PK1中p38 MAPK(mitogen-actived protein kinase)蛋白表現量的西方墨點法試驗結果圖。
【0057】 圖9為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物對ACEs誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa、1-3kDa PP)共培養48小時後，腎絲球RMC細胞中Fin1(Fibronertin)蛋白表現量的西方墨點法試驗結果圖。
【0058】 圖10為本發明的一實施例，一種適用於慢性腎病患者的小球藻的萃取流程。
【實施方式】【0024】 下述將參照所附圖式敘明以更充分地描述本發明之部分實施態樣，惟本發明實施態樣並不限於說明書所例示。
【0025】 實施例1 小球藻機能性萃取物(多醣萃取物)之製備與分析
【0026】 本發明實施例係以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa,CP)為試驗材料進行之。相類的小球藻亦可應用於試驗。首先，取100g小球藻粉末，以蒸餾水400ml進行溶解，將著利用閃式萃取器破碎藻體10分鐘，萃取2次，接著利用1.5%的胰蛋白酶(pH為7.5)，於40℃下，進行酶解約2小時，進行藻體酶解並增加多醣含量，之後將小球藻多醣提取液進行除蛋白，乙醇分級沉澱後，進行管柱層析(Sepharose DEAE-52)，將其分離純化以獲得小球藻多醣萃取液。
【0027】 由於不同分子量之多醣具有不同作用，藉由離心過濾分離操作技術，如利用超濃縮過濾離心管(Vivaspin turbo 15)進行濃縮過濾，將15ml萃取液置入離心管，以最大離心力4000×g離心10分鐘，最後利用微量吸管吸取於濃縮物管底部的樣本，以製備極小分子多醣(Mw<3kDa)，小分子多醣(Mw：3-10kDa)，一般分子多醣(Mw：>10kDa)等不同分子量大小範圍的各種小球藻多醣樣品，以利後續進行的體外細胞毒性與藥理活性試驗。
【0028】 透過總醣(苯酚硫酸法)扣除還原醣(DNS法)可得知，不同分子量的小球藻多醣樣品其分佈比例如下表1，從表1可知，<3kDa的小球藻多醣佔約總多醣含量的56%為最高，其次為>10kDa的32%及3-10kDa的12%，然而活性多醣β-1,3-葡聚醣的含量反而是3-10kDa組別分布較高，約占43%。同時透過傅立葉轉換紅外光譜(FT-IR)中及核磁共振儀(1H-NMR)中，亦可以分別在FT-IR在硫酸多醣的848C-O-S及1230S=O上及4.35-4.55ppm上出現連續波峰，進行檢測出小球藻多醣樣品中存在著磷酸多醣結構的存在(圖中未示)，且>10kDa及3-10kDa所含磷酸多醣的比例較高。
【0029】 
【0030】 實施例2 小球藻機能性萃取物(多肽萃取物)之製備與分析
【0031】 取100g小球藻粉末，加入液態氮加以破壞細胞壁，並以去離子水3,000ml加以進行溶解。再使用高壓滅菌鍋中萃取20分鐘(121℃、1.2kg/cm2)，上述步驟重覆三次，待懸浮液冷卻後，離心20分鐘(8800g)，之後收集上清液，再將上清液加入胃蛋白酶加以進行酶解反應，反應完成後再以四倍體積95%酒精進行沉澱。再將其離心(8800g，20分鐘)後之沉澱物以等體積75%酒精清洗兩次，最後將沉澱物進行凍乾，保存於防潮箱以備用。接著，進行中空纖維管柱(Hollow fiber)之分離，並在分離前進行管柱預處理，將管柱內保存溶液洗脫出管柱外，並以食品級氫氧化鈉(NaOH)清洗管柱後備用。樣本的小分子胜肽分離，將小球藻蛋白萃取物以幫浦注入特殊規格管柱內進行管膜分離過程，並設定自動跳停記錄其時間，即可獲製多肽萃取物。本實施例中，共製備小肽(Mw<1kDa)，短肽(Mw：1-3kDa)，多肽(Mw：3-10kDa)、泛胜肽(Mw：<10kDa)與可溶性蛋白(Mw>10kDa)等5個不同分子量大小範圍的小球藻蛋白胜肽等樣本，待產品完全分離完後取出並進行胜肽與胺基酸分析。
【0032】 經分析，小球藻胜肽萃取物之胜肽濃度約為4.98mg/ml，如表2所示。
【0033】 
【0034】 同時透過膠透滲層析法，測得相對蛋白質分子量的分佈比例，其中小球藻蛋白萃取物分子量>3kDa約佔71%，分子量1-3kDa與<1kDa約佔29%，如表3所示。
【0035】 
【0036】 最後，透過OPA及FMOC試劑將稀釋過後的PP樣品以高效能液相層析儀進行分析後，得到胜肽萃取液各種胺基酸及總胺基酸含量如表4所示。並根據前述結果，分別以不同分子量的小球藻多醣萃取物(PS)樣品組別及小球藻胜肽萃取物(PP)樣品，分別進行相關毒理及分子生物學試驗，以評估本案發明所請一種適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物的效果。
【0037】 
【0038】 請參閱圖1，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經萃取後分別以多醣萃取組(PS)及蛋白萃取組(PP)根據不同分子量的分組(<3kDa PS 3-10kDa PS及>10kDa PS)與不同分子量(<1kDa PP 1-3kDa PP及>3kDa PP)對巨噬細胞RAW264.7進行細胞存活率分析(MTT)，其結果顯示，不論PS或PP的何種組別，對巨噬細胞RAW264.7皆不具有毒性。
【0039】 請參閱圖2，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經萃取後分別以多醣萃取組(PS)及蛋白萃取組(PP)根據不同分子量的分組(<3kDa PS 3-10kDa PS及>10kDa PS)與不同分子量(<1kDa PP 1-3kDa PP及>3kDa PP)對腎小管細胞LLC-PK1進行細胞存活率分析(MTT)，其結果顯示，不論PS或PP的何種組別，對腎小管細胞LLC-PK1皆不具有毒性。
【0040】 請參閱圖3，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經萃取後分別以多醣萃取組(PS)及蛋白萃取組(PP)根據不同分子量的分組(<3kDa PS 3-10kDa PS及>10kDa PS)與不同分子量(<1kDa PP 1-3kDa PP及>3kDa PP)對腎絲球細胞RMC進行細胞存活率分析(MTT)，其結果顯示，不論PS或PP的何種組別，對腎絲球細胞RMC皆不具有毒性。
【0041】 請參閱圖4，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經不同溶劑萃取後，使用ELISA法對測定使用LPS誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa PP、1-3kDa PP)共培養48小時後，巨噬細胞RAW264.7的IL-1β(A)表現量。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為>10kDa PS。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為<1kDa PP。
【0042】 請參閱圖5，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經不同溶劑萃取後，使用ELISA法對測定使用LPS誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa PP、1-3kDa PP)共培養48小時後，巨噬細胞RAW264.7的TNF-α(B)表現量。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為>10kDa PS。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為1-3kDa PP。
【0043】 請參閱圖6，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經不同溶劑萃取後，使用ELISA法對測定使用STZ誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa PP、1-3kDa PP)共培養48小時後，腎小管細胞LLC-PK1細胞的RANT Es(C)表現量。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為3-10kDa PS。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為<1kDa。
【0044】 請參閱圖7，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經不同溶劑萃取後，使用ELISA法對測定使用ACEs誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa PP、1-3kDa PP)共培養48小時後，腎絲球RMC細胞的MCP-1表現量。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為>10kDa PS。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為1-3kDa PP。
【0045】 請參閱圖8，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經不同溶劑萃取後，對STZ誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa PP、1-3kDa PP)共培養48小時後，腎小管細胞LLC-PK1中p38 MAPK(mitogen-actived protein kinase)蛋白表現量的西方墨點法試驗結果(Western blot,p38 MAPK)。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為3-10kDa PS。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為<1kDa PP。
【0046】 請參閱圖9，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物經不同溶劑萃取後，對ACEs誘導及分別以多醣萃取組(3-10kDa PS、>10kDa PS)及蛋白萃取組(<1kDa PP、1-3kDa PP)共培養48小時後，腎絲球RMC細胞中Fin1(Fibronertin)蛋白表現量的西方墨點法試驗結果。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為>10kDa PS。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物為<1kDa PP。
【0047】 請參閱圖10，根據本發明之適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物的萃取流程圖。較佳的，前述實施例中，該適用於慢性腎病患者的小球藻機能性萃取物，所選小球藻為蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，但並不僅限於此。