【技術領域】【0001】 本發明是有關於一種層析檢測裝置，特別是指一種免疫層析檢測裝置。
【先前技術】【0002】 利用免疫層析檢測裝置進行生物檢測是普遍且方便的方法之一，且目前已被廣泛地應用於臨床篩檢、海關檢測、法醫鑑定等。該免疫層析檢測裝置是透過抗原或抗體與檢體中的病原體結合的專一性來做為檢測依據，同時，使用奈米等級膠體金顆粒(colloidal gold)作為顯色劑，用以確認檢體中是否有病原體的存在。然而，過去的免疫層析檢測裝置的纖維素層析膜的表面具有容易沾黏生物分子的問題，導致免疫層析檢測裝置的靈敏度不佳。
【發明內容】【0003】 因此，本發明的目的，即在提供一種具有良好的靈敏度的免疫層析檢測裝置。
【0004】 於是，本發明免疫層析檢測裝置，用來檢測檢體中是否具有病原體，且包含一纖維素層析膜、一檢測單元及一基板。
【0005】 該纖維素層析膜包括一第一表面及相反於該第一表面的第二表面、一第一端部及相反於該第一端部的第二端部，且包括複數纖維素纖維及複數鍵結在該等纖維素纖維上的抗生物沾黏共聚物，其中，該等抗生物沾黏共聚物是由第一化合物的雙鍵與第二化合物的雙鍵進行聚合反應所形成。該第一化合物選自甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸羥乙酯或CH2=C(CH3)-C(O)-O-CH2-C(O)H。該第二化合物選自磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯或磺基甜菜鹼丙烯醯胺。
【0006】 該檢測單元用來與經該纖維素層析膜擴散的該檢體作用，且設置在該纖維素層析膜的該第一表面上，並包括由該纖維素層析膜的該第一端部至該第二端部的方向依序設置的一擴散層、一奈米金層、一檢測層、一控制層，及一吸液層。
【0007】 該擴散層用來擴散該檢體。該奈米金層連接該擴散層，且包括複數用來捕捉該病原體而形成複數複合體的可脫離的奈米金膠體，其中，每一奈米金膠體具有用來捕捉該病原體的第一專一結合劑及負載該第一專一結合劑的奈米金粒子。該檢測層與該奈米金層間隔設置，且包括用來捕捉該等複合體的病原體的第二專一結合劑。該控制層與該檢測層間隔設置，且包括用來與該奈米金膠體結合的第三專一結合劑。該吸液層與該控制層間隔設置，且用來吸收通過該控制層的該檢體。
【0008】 該基板設置在該纖維素層析膜的第二表面。
【0009】 本發明的功效在於：透過該纖維素層析膜的該等抗生物沾黏共聚物，能夠避免該檢體中的該病原體沾黏於該纖維素層析膜的該第一表面，藉以提升該免疫層析檢測裝置檢測該病原體的靈敏度。
【圖式簡單說明】【0049】 本發明的其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1是本發明免疫層析檢測裝置的一實施例的立體圖。
【實施方式】【0010】 在本發明被詳細描述之前，要注意的是，在以下的說明內容中，類似的元件是以相同的編號來表示。
【0011】 參閱圖1，本發明免疫層析檢測裝置能夠用來檢測檢體10中是否具有複數病原體。該檢體10例如人體體液、血液、尿液、口水、鼻腔黏膜等等。該病原體例如癌胚胎抗原(carcinoembryonic antigen，簡稱CEA)或纖維蛋白原(fibrinogen)。本發明免疫層析檢測裝置的一第一實施例包含一纖維素層析膜1、一檢測單元2，及一基板3。
【0012】 該纖維素層析膜1包括一第一表面11及相反於該第一表面11的第二表面12、一第一端部13及相反於該第一端部13的第二端部14，且包括複數纖維素纖維及複數鍵結在該等纖維素纖維上的抗生物沾黏共聚物。
【0013】 該等抗生物沾黏共聚物是由第一化合物的雙鍵與第二化合物的雙鍵進行聚合反應所形成。該第一化合物選自甲基丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl methacylate，以下簡稱GMA)、甲基丙烯酸羥乙酯或CH2=C(CH3)-C(O)-O-CH2-C(O)H，而該第二化合物選自磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯(sulfobetaine methacrylate，以下簡稱SBMA)或磺基甜菜鹼丙烯醯胺。該等抗生物沾黏共聚物透過環氧基、羥基及醛基與該等纖維素纖維鍵結在一起，進而使該抗生物沾黏共聚物能夠牢固地鍵結在該等纖維素纖維上。透過該等抗生物沾黏共聚物，在該等病原體隨著該檢體10擴散並移動的過程中，能夠避免該病原體沾黏於該纖維素層析膜1的該第一表面11，進而導致該免疫層析檢測裝置無法檢測到該等病原體的問題發生。
【0014】 為使本發明免疫層析檢測裝置具有較佳地靈敏度，在本發明的一些實施態樣中，該等抗生物沾黏共聚物的該第一化合物與該第二化合物的莫耳比例範圍為20：80至80：20。
【0015】 在該第一實施例中，該第一化合物為甲基丙烯酸縮水甘油酯，且該第二化合物為磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯，而該第一化合物與該第二化合物的莫耳比例為40：60。在該第一實施例中，該纖維素層析膜1是由一方法所形成，且該方法包含步驟(a)及步驟(b)。
【0016】 步驟(a)：將0.020克的偶氮二異丁腈及5.126克的甲醇混合，形成第一溶液。將1.021克(0.003654mol)的磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯及1.709克的水混合，形成第二溶液。接著，將該第一溶液、該第二溶液與332.3μL(0.002436mol)的甲基丙烯酸縮水甘油酯混合，且於氮氣環境下加熱至60℃進行6小時的聚合反應，形成包含複數抗生物沾黏共聚物的第一混合物，其中，該甲基丙烯酸縮水甘油酯與該磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯的莫耳比例為40：60。將該第一混合物置於0℃的冰浴中30分鐘，得到一第二混合物。在該第二混合物中加入甲醇，使該等抗生物沾黏共聚物自該第二混合物中析出，然後，進行過濾，獲得該等抗生物沾黏共聚物。依序利用一台真空烘箱及一台冷凍乾燥機，對該等抗生物沾黏共聚物進行乾燥處理。
【0017】 步驟(b)：將20mg的抗生物沾黏共聚物、200μL的氨水(作為催化劑)及20mL的水混合，形成共聚物溶液，其中，該共聚物溶液的pH值約為11，且在該共聚物溶液中，該等抗生物沾黏共聚物的濃度為1mg/mL。將纖維素膜浸入該共聚物溶液中，然後，置於一台搖擺烘箱中，且於110rpm旋轉速率下在70℃下反應15小時，使該等抗生物沾黏共聚物鍵結在該纖維素膜的纖維素纖維上，形成該纖維素層析膜1。
【0018】 該檢測單元2用來與經該纖維素層析膜1擴散的該檢體10作用，且設置在該纖維素層析膜1的該第一表面11上。
【0019】 該檢測單元2包括由該纖維素層析膜1的該第一端部13至該第二端部14的方向依序設置的一擴散層21、一奈米金層22、一檢測層23、一控制層24，及一吸液層25。
【0020】 該擴散層21用來吸收該檢體10並將該檢體10擴散至該奈米金層22。該擴散層21例如纖維素紙或硝酸化纖維素膜等。在該第一實施例中，該擴散層21為纖維素紙。
【0021】 該奈米金層22連接該擴散層21，且包括本體及附著該本體的複數可脫離的奈米金膠體。該本體例如纖維素紙。在該第一實施例中，該本體為纖維素紙。該等奈米金膠體用來捕捉該病原體而與該等病原體形成複數複合體。每一奈米金膠體具有用來捕捉該等病原體的第一專一結合劑，及負載該第一專一結合劑的奈米金粒子。該第一專一結合劑例如抗原或抗體等。在該第一實施例中，該第一專一結合劑為抗體。當該檢體10中具有該等病原體時，該等病原體會與該等奈米金膠體形成該等複合體，並與部分的該等奈米金膠體一起隨著該檢體10擴散並移動至該纖維素層析膜1的該第一表面11上。當該檢體10中無病原體時，則該等奈米金膠體隨著該檢體10擴散並移動至該纖維素層析膜1的第一表面11上。
【0022】 該檢測層23與該奈米金層22間隔設置，且包括用來捕捉該等複合體的病原體的第二專一結合劑。該第二專一結合劑例如抗原或抗體等。在該第一實施例中，該第二專一結合劑為一級抗體。當該檢體10擴散至該檢測層23，且該檢體10中具有該等複合體時，則該等複合體的病原體會與該第二專一結合劑結合並使該檢測層23產生顏色變化；當該檢體10中無該等複合體而只有該等奈米金膠體，則該等奈米金膠體不會與該第二專一結合劑結合，因此不會產生顏色變化。在該第一實施例中，該第二專一結合劑為無色，而當該等複合體的病原體與該第二專一結合劑結合後，顏色轉變成紅色。
【0023】 該控制層24與該檢測層23間隔設置，且包括用來與該奈米金膠體結合的第三專一結合劑。該第三專一結合劑例如抗原或抗體等。在該第一實施例中，該第三專一結合劑為二級抗體。該檢體10擴散至該控制層24時，該檢體10中的該等奈米金膠體與該第三專一結合劑結合並使該控制層24產生顏色變化。在本實施例中，該第三專一結合劑為無色，而當該等複合體的病原體與該第三專一結合劑結合後，顏色轉變成紅色。
【0024】 該吸液層25與該控制層24間隔設置，且用來吸收通過該控制層24的該檢體。該吸液層25例如纖維素紙或棉墊等。在該第一實施例中，該吸液層25為纖維素紙。
【0025】 該基板3設置在該纖維素層析膜1的第二表面12。該基板3例如聚對苯二甲酸乙二醇(PET)基板或聚丙烯(PP)基板等。在該第一實施例中，該基板3為聚丙烯基板。
【0026】 本發明免疫層析檢測裝置之一第二實施例與該第一實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：抗生物沾黏共聚物，且將該第一實施例之形成該纖維素層析膜1的步驟(a)的第二溶液中的磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯置換成磺基甜菜鹼丙烯醯胺，且該第二溶液包含0.732克(0.00263mol)的磺基甜菜鹼丙烯醯胺及3.68克的水。
【0027】 本發明免疫層析檢測裝置之一第三實施例與該第一實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：抗生物沾黏共聚物，且將該第一實施例之形成該纖維素層析膜1的步驟(a)中的甲基丙烯酸縮水甘油酯置換成304.23μL(0.002435mol)的甲基丙烯酸羥乙酯。
【0028】 本發明免疫層析檢測裝置之一第四實施例與該第三實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：抗生物沾黏共聚物，且將該第三實施例之形成該纖維素層析膜1的步驟(a)的第二溶液中的磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯置換成磺基甜菜鹼丙烯醯胺，且該第二溶液包含0.7318克(0.00263mol)的磺基甜菜鹼丙烯醯胺及3.679克的水。
【0029】 本發明免疫層析檢測裝置之一第五實施例與該第一實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：抗生物沾黏共聚物，且將該第一實施例之形成該纖維素層析膜1的步驟(a)中的甲基丙烯酸縮水甘油酯置換成280.5265μL(0.002436mol)的CH2=C(CH3)-C(O)-O-CH2-C(O)H。
【0030】 本發明免疫層析檢測裝置之一第六實施例與該第五實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：抗生物沾黏共聚物，且將該第五實施例之形成該纖維素層析膜1的步驟(a)的第二溶液中的磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯置換成磺基甜菜鹼丙烯醯胺，且該第二溶液包含0.7318克(0.00263mol)的磺基甜菜鹼丙烯醯胺及5.1108克的水。
【0031】 本發明免疫層析檢測裝置之一第七實施例與該第一實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：抗生物沾黏共聚物，該第七實施例之形成該纖維素層析膜1的步驟(a)中，是使用166.15μL(0.00122mol)的甲基丙烯酸縮水甘油酯及1.36克(0.0049mol)的磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯，其中，該甲基丙烯酸縮水甘油酯與該磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯的莫耳比例為20：80。
【0032】 本發明免疫層析檢測裝置之一第八實施例與該第一實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：抗生物沾黏共聚物，該第八實施例之形成該纖維素層析膜1的步驟(a)中，是使用249.23μL(0.0018mol)的甲基丙烯酸縮水甘油酯及1.19克(0.0043mol)的磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯，其中，該甲基丙烯酸縮水甘油酯與該磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯的莫耳比例為30：70。
【0033】 本發明免疫層析檢測裝置之一第九實施例與該第一實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：抗生物沾黏共聚物，該第九實施例之形成該纖維素層析膜1的步驟(a)中，是使用498.46μL(0.0037mol)的甲基丙烯酸縮水甘油酯及0.68克(0.0024mol)的磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯，其中，該甲基丙烯酸縮水甘油酯與該磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯的莫耳比例為60：40。
【0034】 本發明免疫層析檢測裝置之一第十實施例與該第一實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：抗生物沾黏共聚物，該第十實施例之形成該纖維素層析膜1的步驟(a)中，是使用664.61μL(0.0049mol)的甲基丙烯酸縮水甘油酯及0.34克(0.0012mol)的磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯，其中，該甲基丙烯酸縮水甘油酯與該磺基甜菜鹼甲基丙烯酸酯的莫耳比例為80：20。
【0035】 為能夠凸顯該第一實施例至第十實施例的免疫層析檢測裝置的靈敏度，提供一第一比較例的免疫層析檢測裝置。
【0036】 該第一比較例的免疫層析檢測裝置與該第一實施例的免疫層析檢測裝置類似，主要不同在於：該第一比較例的纖維素層析膜1中沒有抗生物沾黏共聚物。
【0037】 [評價項目]
【0038】 將第一實施例至第十實施例的免疫層析檢測裝置的纖維素層析膜及第一比較例的免疫層析檢測裝置的纖維素層析膜進行以下評價。為了清楚說明，以下評價項目的測試流程以第一實施例作為代表進行描述。
【0039】 相對牛血清蛋白貼附量量測：將第一實施例的纖維素層析膜置於1.0mL的磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline)中，並置於一台37℃的熱風循環烘箱中靜置6小時，接著，將該磷酸鹽緩衝生理鹽水移除，並利用磷酸鹽緩衝生理鹽水潤洗該纖維素層析膜3次。然後，將該纖維素層析膜浸泡於1mL的牛血清蛋白溶液，並放置於一台37℃的熱風循環烘箱中靜置30分鐘，接著，利用定量吸管將該牛血清蛋白溶液吸出，並利用磷酸鹽緩衝生理鹽水潤洗該纖維素層析膜3次。然後，將該纖維素層析膜浸泡於1mL的二辛可寧酸(bicinchoninc acid，簡稱BCA)顯影液中，並放置於一台37℃的熱風循環烘箱中靜置30分鐘，形成包含牛血清蛋白的顯色液，接著，利用定量吸管吸取200μL的包含牛血清蛋白的顯色液，並將該包含牛血清蛋白的顯色液置於96孔盤中，然後，利用一台微量盤式分光光譜儀(Microplate Spectrophotometer；廠牌：BMG LABTECH；型號：SPECTROstar Nano)以波長562nm對該包含牛血清蛋白的顯影液進行量測，從而計算出該纖維素層析膜的表面上的牛血清蛋白貼附量(mg/mL)。以量測第一比較例所獲得的牛血清蛋白貼附量歸一化，視為100%，並計算出量測各實施例所獲得的牛血清蛋白貼附量相對於該第一比較例所獲得的牛血清蛋白貼附量的相對牛血清蛋白貼附量(%)。
【0040】 相對重組人溶菌酶(Lysozyme Human)貼附量量測：將第一實施例的纖維素層析膜置於1.0mL的磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline)中，並置於一台37℃的熱風循環烘箱中靜置6小時，接著，將該磷酸鹽緩衝生理鹽水移除，並利用磷酸鹽緩衝生理鹽水潤洗該纖維素層析膜3次。然後，將該纖維素層析膜浸泡於1mL的重組人溶菌酶溶液，並放置於一台37℃的熱風循環烘箱中靜置30分鐘，接著，利用定量吸管將該重組人溶菌酶溶液吸出，並利用磷酸鹽緩衝生理鹽水潤洗該纖維素層析膜3次。然後，將該纖維素層析膜浸泡於1mL的二辛可寧酸顯影液中，並放置於一台37℃的熱風循環烘箱中靜置30分鐘，形成包含重組人溶菌酶的顯色液，接著，利用定量吸管吸取200μL的包含重組人溶菌酶的顯色液，並將該包含重組人溶菌酶的顯色液置於96孔盤中，然後，利用一台微量盤式分光光譜儀(Microplate Spectrophotometer；廠牌：BMG LABTECH；型號：SPECTROstar Nano)以波長562nm對該包含重組人溶菌酶的顯影液進行量測，從而計算出該纖維素層析膜的表面上的重組人溶菌酶貼附量(mg/mL)。以量測第一比較例所獲得的重組人溶菌酶貼附量歸一化，視為100%，並計算出量測各實施例所獲得的重組人溶菌酶貼附量相對於該第一比較例所獲得的重組人溶菌酶貼附量的相對重組人溶菌酶貼附量(%)。
【0041】 相對人體纖維蛋白原(Human Fibrinogen)貼附量量測：將第一實施例的纖維素層析膜置於1.0mL的磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline)中，並置於一台37℃的熱風循環烘箱中靜置6小時，接著，將該磷酸鹽緩衝生理鹽水移除，並利用磷酸鹽緩衝生理鹽水潤洗該纖維素層析膜3次。然後，將該纖維素層析膜浸泡於1mL的人體纖維蛋白原溶液，並放置於一台37℃的熱風循環烘箱中靜置30分鐘，接著，利用定量吸管將該人體纖維蛋白原溶液吸出，並利用磷酸鹽緩衝生理鹽水潤洗該纖維素層析膜3次。然後，將該纖維素層析膜浸泡於1mL的二辛可寧酸顯影液中，並放置於一台37℃的熱風循環烘箱中靜置30分鐘，形成包含人體纖維蛋白原的顯色液，接著，利用定量吸管吸取200μL的包含人體纖維蛋白原的顯色液，並將該包含人體纖維蛋白原的顯色液置於96孔盤中，然後，利用一台微量盤式分光光譜儀(Microplate Spectrophotometer；廠牌：BMG LABTECH；型號：SPECTROstar Nano)以波長562nm對該包含人體纖維蛋白原的顯影液進行量測，從而計算出該纖維素層析膜的表面上的人體纖維蛋白原貼附量(mg/mL)。以量測第一比較例所獲得的人體纖維蛋白原貼附量歸一化，視為100%，並計算出量測各實施例所獲得的人體纖維蛋白原貼附量相對於該第一比較例所獲得的人體纖維蛋白原貼附量的相對人體纖維蛋白原貼附量(%)。
【0042】 靈敏度量測：將1μL的抗人體纖維素蛋白的抗體加至1mL的pH值為6的奈米金粒子懸浮液中，並使用一台迴轉式震盪器在27℃下以70rpm離心30分鐘，形成第一混合液。於該第一混合液中加入100μL的牛血清蛋白溶液(牛血清蛋白的濃度為50mg/mL)，並以70rpm的轉速離心30分鐘，接著，於4℃下以9600rcf的離心力進行20分鐘的離心處理，產生分層，並取出上清液，然後，於該上清液中加入1mL的磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)，於4℃下以9600rcf的離心力進行20分鐘的離心處理，產生分層，並取出上清液。於該上清液中加入1mL的磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)與200μL的牛血清蛋白溶液(牛血清蛋白的濃度為10mg/mL)，形成第二混合液。將50μL的該第二混合液置於96孔盤中，並提供四個第一實施例的纖維素層析膜1，且將該等第一實施例的纖維素層析膜1的該等第一表面11的中央分別塗覆濃度為1mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL的人體纖維素蛋白溶液，接著，將該等第一實施例的纖維素層析膜1垂直置於該96孔盤中180秒，得到待測樣品。然後，以一台電腦(廠牌：ASUS；型號：VivoBook15)搭配image j軟體對該待測樣品進行灰階值量測，結果如表2所示。重複上述實驗，並將奈米金粒子懸浮液的pH改變為7、8、9及10，結果如表2所示。
【0043】 
【0044】 由表1可知，相較於比較例1，在本發明第一實施例及第七實施例至第十實施例中，透過該等抗生物沾黏共聚物，確實能夠減少該檢體中的該病原體沾黏於該纖維素層析膜的該第一表面。
【0045】 
【0046】 由表2可知，相較於第一比較例，本發明第一實施例的免疫層析檢測裝置，因具有該抗生物沾黏共聚物，對於人體纖維素蛋白的濃度為0.05mg/mL的條件下，還能夠檢測到人體纖維素蛋白訊號，甚至在濃度為0.05mg/mL至1mg/mL的條件下，具有高的訊號強度，因此，本發明免疫層析檢測裝置確實能夠具有優異的靈敏度。
【0047】 綜上所述，透過該等抗生物沾黏共聚物，能夠避免該檢體10中的該病原體沾黏於該纖維素層析膜1的該第一表面11，藉以提升該免疫層析檢測裝置檢測該病原體的靈敏度，故確實能達成本發明的目的。
【0048】 惟以上所述者，僅為本發明的實施例而已，當不能以此限定本發明實施的範圍，凡是依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作的簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋的範圍內。