【技術領域】本發明是有關於一種紅石榴果實的脂溶性萃取物(lipid soluble extract of Punica granatum L.fruits)暨其製備方法。本發明亦有關於該紅石榴果實的脂溶性萃取物在製備供用於治療膀胱癌(bladder cancer)的藥學組成物上的用途。
【先前技術】膀胱癌[亦被稱為膀胱移行性上皮細胞癌(transitional cell carcinomas of urinary bladder)或者膀胱上皮細胞癌(urothelial cell carcinomas of urinary bladder)]主要是一種由位在膀胱(urinary bladder)的移形上皮細胞(transitional epithelium)[亦被稱為尿路上皮細胞(urothelium)]的不正常增生(abnormal proliferation)所引起的癌症。至今，膀胱癌的形成機制仍是未知，但是有研究顯示，下面的風險因子可能會導致膀胱癌：行為(behavioral)，例如抽菸(cigarette smoking)；化學暴露(chemical exposure)，例如井水中的砷(arsenic in well water)；慢性感染(chronic infection)，例如膀胱結石(bladder calculi)、慢性膀胱感染(chronic bladder infection)以及生殖泌尿道結核病(genitourinary tuberculosis)等；醫源性因子(iatrogenic factor)，例如環磷酸醯胺(cyclophosphamide)以及骨盆放射治療(pelvic radiation therapy)；以及職業性因子(occupational factor)，例如暴露於用於製造化學染劑或醫藥品的芳香族胺化物(aromatic amines)[諸如β-萘胺(β-naphthylamine)]當中(Sanjeev Sharma,MD et al.(2009),American Family Physician,80：717-723)。
依據癌細胞的侵入位置，膀胱癌可以被區分為非肌肉-侵入性(nonmuscle-invasive)膀胱癌、肌肉-侵入性(muscle-invasive)膀胱癌以及轉移性(metastatic)膀胱癌。目前西方醫學主要是依照膀胱癌的病症程度來給予不同的治療方法，它們大致可被歸納為下面4大類：(1)尿道膀胱腫瘤切除術(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)：將膀胱鏡經由尿道而延伸至膀胱內來進行腫瘤的切除，通常用於治療非肌肉-侵入性膀胱癌；(2)膀胱內灌注療法(bladder instillation therapy)：將絲裂霉素(mitomycin)或者卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)等藥物藉由使用導尿管而注入至膀胱內，此種治療方法通常會在TURBT之後伴隨著被進行；(3)膀胱切除術(cystectomy)：依據癌細胞侵入至肌肉層中的範圍與嚴重程度來切除局部或者全部的膀胱，通常用於治療肌肉-侵入性膀胱癌；以及(4)全身性化學療法(systemic chemotherapy)：目前的照護標準是藉由使用吉西他濱(gemcitabine)以及順鉑(cisplatin)的組合來作為第一線的治療藥物，通常用於治療肌肉-侵入性膀胱癌以及轉移性膀胱癌。
然而上面所提及的外科手術和/或藥物無法達到所欲的療效並且可能會導致患者產生嚴重的副作用(side effects)，因此，本領域的相關研究人員嘗試從傳統中藥(traditional Chinese medicines,TCM)中來尋找可供用於治療膀胱癌的活性組分(active components)。
紅石榴(拉丁學名：Punica granatum L.；英文俗名：Pomegranate；漢語拼音：shi liu；中文別名：石榴或安石榴)是千屈菜科(Lythraceae)石榴亞科(Punicoideae)石榴屬(Punica)的落葉灌木；葉對生或近簇生，外觀呈矩圓形或倒卵形；花生於枝頂或腋生；漿果近球形，呈紅色，有肉質外皮。產區主要分佈於伊朗、印度北方的喜馬拉雅山脈、中國、美國以及地中海區域等。
紅石榴的主要利用部位為葉、花、果皮以及根。在中國民俗醫學上，紅石榴的果皮被用於治療鼻衄、中耳炎、創傷出血、月經失調、紅崩白帶、牙痛、吐血、久瀉、久痢、便血、脫肛、滑精、崩漏、帶下、蟲積腹痛以及疥癬。另外，有文獻指出，紅石榴具有抗氧化(antioxidant)、抗發炎(antiinflammatory)、抗病毒(antiviral)、抗細菌(antibacterial)、抗真菌(antifungal)以及抗癌(anticancer)[包括前列腺癌(prostate cancer)、結腸癌(colon cancer)、乳癌(breast cancer)、皮膚癌(skin cancer)、肺癌(lung cancer)、子宮頸癌(cervical cancer)以及白血病(leukemia)]等功效，並且可用於改善心血管健康(cardiovascular health)、預防糖尿病(diabetes)、緩解停經症狀(menopausal symptoms)、改善勃起失能(erectile dysfunction)、治療阿茲海默症(Alzheimer’s disease)以及類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)等(Julie Jurenka,MT(2008),Alternative Medicine Review,13：128-144；Suzanne D.Johanningsmeier et al.(2011),Annu.Rev.Food Sci.Technol.2：181-201)。
CN 103505480 A揭示一種石榴皮抗腫瘤多酚有效部位，其製備方法包括：在一範圍落在10至40℃內的溫度下，將紅石榴的乾燥果皮以30至60%乙醇(ethanol)進行萃取歷時15至60分鐘，由此所得到的石榴皮乙醇萃取物被添加至填裝有大孔吸附樹脂的管柱中，繼而以乙醇來進行洗脫。接著，收集乙醇洗脫液並以真空冷凍乾燥來移除乙醇，藉此而得到一呈粉末狀的石榴皮抗腫瘤多酚有效部位。依據此件大陸專利公開案所製得的石榴皮抗腫瘤多酚有效部位被拿來進行6種癌細胞(包括人類乳腺癌細胞MCF-7、癌細胞DBL7404、人類前列腺癌細胞PC-3、人類結腸癌細胞Caco-2、人類黑色素瘤細胞A375以及人類子宮頸上皮癌細胞HeLa)的細胞可活性分析(cell viability analysis)，而實驗結果顯示，該石榴皮抗腫瘤多酚有效部位可以有效地抑制該等癌細胞的生長。
在Song-Tay Lee et al.(2013),BMC Complementary and Alternative Medicine,13：364中，Song-Tay Lee等人將新鮮的紅石榴果實(fresh pomegranate fruit)去除果皮(peeled)，接著將可食用部分拿來進行一擠壓處理，而得到一紅石榴果汁。之後，將該紅石榴果汁(37.5mL)進行冷凍乾燥(freeze dried)而得到一冷凍乾燥粉末(4.13g)。由此所得到的冷凍乾燥粉末以乙酸乙酯在室溫下進行萃取歷時16小時，繼而在一為10,000g的離心速度下進行離心歷時10分鐘，接著移除上澄液並收集所形成的殘餘物(residue)。之後，將該殘餘物以70%乙醇進行萃取歷時24小時，藉此而得到一紅石榴果汁的萃取物。接著，所得到的紅石榴果汁的萃取物被拿來進行人類膀胱癌細胞株T24以及J82的細胞可活性分析，而實驗結果發現：該紅石榴果汁的萃取物可以有效地抑制該等人類膀胱癌細胞株的增生，因而具有抗膀胱癌的活性。
在Benhong Zhou et al.(2015),Phytother.Res.(DOI：10.1002/ptr.5267)中，Benhong Zhou等人將紅石榴果皮的乾燥粉末(dried powder of pomegranate rind)以90%甲醇水性溶液(methanol aqueous solution)在迴流的條件下進行萃取歷時1小時，之後藉由真空乾燥來移除甲醇而得到一紅石榴果皮之經甲醇萃取的產物。接著，該紅石榴果皮之經甲醇萃取的產物被懸浮於2%水性乙酸(aqueous acetic acid)中，繼而以乙酸乙酯(ethyl acetate,EtOAc)來進行分配分離(partitioning)。之後，收取乙酸乙酯分離部分(EtOAc fraction)並以真空旋轉蒸發(vacuum rotary evaporation)的方式來移除乙酸乙酯，藉此而得到一紅石榴果皮的萃取物。接著，所得到的紅石榴果皮的萃取物被拿來進行人類膀胱癌細胞株EJ的細胞可活性分析以及被拿來餵食給帶有人類膀胱癌細胞株EJ-誘發的腫瘤之裸鼠，而實驗結果發現：該紅石榴果皮的萃取物可以在活體外(in vitro)抑制人類膀胱癌細胞株EJ的增生，並且可以減少該裸鼠體內的腫瘤體積，因而具有抗膀胱癌的活性。
為了從天然植物中開發出新穎且可以有效地治療膀胱癌的藥物，申請人嘗試以新鮮的紅石榴果實來進行萃取而得到一紅石榴果實的脂溶性萃取物，它經由活體外實驗而被證實具有一優異的抑制膀胱癌細胞生長的效用。因此，本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物被預期可供用於治療膀胱癌。
【發明內容】發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種紅石榴果實的脂溶性萃取物(lipid soluble extract of Punica granatum L.fruits)，它是藉由一包含下列步驟之方法而被製得：(a)以一乙醇溶液來萃取紅石榴果實而得到一乙醇萃取物；(b)令該乙醇萃取物進行一使用一由乙酸乙酯與水所構成之溶劑混合物的分配處理，俾以形成一乙酸乙酯層以及一水層；以及(c)收集該乙酸乙酯層，繼而移除乙酸乙酯，藉此而得到該紅石榴果實的脂溶性萃取物。
在第二個方面，本發明提供一種用於製備一紅石榴果實的脂溶性萃取物的方法，其包含下列步驟：(a)以一乙醇溶液來萃取紅石榴果實而得到一乙醇萃取物；(b)令該乙醇萃取物進行一使用一由乙酸乙酯與水所構成之溶劑混合物的分配處理，俾以形成一乙酸乙酯層以及一水層；以及(c)收集該乙酸乙酯層，繼而移除乙酸乙酯，藉此而得到該紅石榴果實的脂溶性萃取物。
在第三個方面，本發明提供一種用於治療膀胱癌的藥學組成物，其包含有一如上所述的紅石榴果實的脂溶性萃取物。
在第四個方面，本發明提供一種用以治療一具有或被懷疑具有膀胱癌之個體的方法，其包括對該個體投藥以一如上所述的紅石榴果實的脂溶性萃取物。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
發明的詳細說明
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
為了開發具有治療膀胱癌效用的新藥物，申請人嘗試以各種處理方式來萃取紅石榴果實(Punica granatum L.fruits)，而成功地得到具有抑制膀胱癌細胞增生以及誘發膀胱癌細胞凋亡的效用之紅石榴果實的脂溶性萃取物。
於是，本發明提供一種紅石榴果實的脂溶性萃取物，它是藉由一包含下列步驟之方法而被製得：(a)以一乙醇溶液來萃取紅石榴果實而得到一乙醇萃取物；(b)令該乙醇萃取物進行一使用一由乙酸乙酯與水所構成之溶劑混合物的分配處理，俾以形成一乙酸乙酯層以及一水層；以及(c)收集該乙酸乙酯層，繼而移除乙酸乙酯，藉此而得到該紅石榴果實的脂溶性萃取物。
本發明亦提供一種用於製備一紅石榴果實的脂溶性萃取物的方法，其包含下列步驟：(a)以一乙醇溶液來萃取紅石榴果實而得到一乙醇萃取物；(b)令該乙醇萃取物進行一使用一由乙酸乙酯與水所構成之溶劑混合物的分配處理，俾以形成一乙酸乙酯層以及一水層；以及(c)收集該乙酸乙酯層，繼而移除乙酸乙酯，藉此而得到該紅石榴果實的脂溶性萃取物。
依據本發明，術語“紅石榴果實(Punica granatum L.fruits)”意指包含有紅石榴的果皮(peel)、果肉(pulp)(亦即可食用的部分)以及種籽(seed)之果實。
依據本發明，該紅石榴果實的脂溶性萃取物可以使用新鮮的紅石榴果實而被製備，或者可使用預先經過一選自於由下列所構成之群組中的加工處理的紅石榴果實而被製備：乾燥處理、研磨處理、切碎處理，以及它們的組合。
依據本發明，在該方法的步驟(a)中，該乙醇溶液具有一範圍落在60%至100%內的濃度。較佳地，該乙醇溶液具有一範圍落在85%至100%內的濃度。在本發明的一個較佳具體例中，該乙醇溶液具有一為100%的濃度。
依據本發明，在該方法的步驟(a)中，該紅石榴果實與該乙醇溶液的用量比例是介於1：3(w/v)至1：10(w/v)之間。較佳地，該紅石榴果實與該乙醇溶液的用量比例是介於1：3(w/v)至1：7(w/v)之間。在本發明的一個較佳具體例中，該紅石榴果實與該乙醇溶液的用量比例是1：3(w/v)。
依據本發明，在該方法的步驟(a)中，該萃取是在一範圍落在25℃至40℃內的溫度下被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該萃取是在室溫下被進行。
依據本發明，在該方法的步驟(b)中，水以及乙酸乙酯的用量比例是介於1：1(v/v)至1：5(v/v)之間。較佳地，水以及乙酸乙酯的用量比例是介於1：1(v/v)至1：3(v/v)之間。在本發明的一個較佳具體例中，水以及乙酸乙酯的用量比例是1：1(v/v)。
依據本發明，在該方法的步驟(b)中，該分配處理是在一範圍落在25℃至40℃內的溫度下被進行。在本發明的一個較佳具體例中，該分配處理是在室溫下被進行。
依據本發明，在該方法的步驟(c)中，該乙酸乙酯層是藉由進一步使用一精煉處理(refining treatment)而被移除乙酸乙酯。該精煉處理可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術[例如，減壓濃縮(decompress concentration)]來進行。
依據本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物經由活體外(in vitro)試驗而被證實對於膀胱癌細胞具有細胞毒性(cytotoxicity)。此外，依據本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物亦經由活體內(in vivo)試驗而被證實可以誘發膀胱癌細胞進行細胞凋亡，進而促使癌細胞死亡，藉此達到抑制癌細胞生長的效用。
基於上述，依據本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物被預期具有治療膀胱癌的效用，因而可供應用於製備一用來治療膀胱癌之醫藥品的用途。
因此，本發明提供一種用於治療膀胱癌的藥學組成物，其包含有一如上所述的紅石榴果實的脂溶性萃取物。
如本文中所用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)、或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。
依據本發明的藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服地(orally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
依據本發明的藥學組成物可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。
本發明亦提供一種用以治療一具有或被懷疑具有膀胱癌之個體的方法，其包括對該個體投藥以一如上所述的藥學組成物。
依據本發明的藥學組成物之投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的藥學組成物的每日投藥劑量通常是0.4mg/Kg體重至0.8mg/Kg體重，呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被口服地投藥。
【圖式簡單說明】本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1顯示將依據本發明的實施例1所製得的紅石榴果實的脂溶性萃取物拿來進行HPLC所得到的洗提圖形，其中波峰a1至a6表示在第0至60分鐘的滯留期間所出現的6個主要成份；圖2顯示將依據Song-Tay Lee et al.(2013)(同上述)所製得的紅石榴果汁的萃取物拿來進行HPLC所得到的洗提圖形，其中波峰b1表示在第0至60分鐘的滯留期間所出現的1個主要成份；圖3顯示人類膀胱上皮細胞E7在以不同濃度的紅石榴果實的脂溶性萃取物予以處理後所測得的細胞可活性百分比，其中對照組(control)表示被處理以DMSO的細胞；實驗組表示被處理以5μg/mL的紅石榴果實的脂溶性萃取物的細胞；圖4顯示人類膀胱癌細胞株T24與J82在分別以不同濃度的紅石榴果實的脂溶性萃取物予以處理後所測得的細胞可活性百分比，其中對照組表示被處理以DMSO的細胞；實驗組1至6表示分別被處理以不同濃度(亦即5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL以及200μg/mL)的紅石榴果實的脂溶性萃取物的細胞；“＊”表示：當與對照組作比較，p<0.05；“＊＊”表示：當與對照組作比較，p<0.01；以及“＊＊＊”表示：當與對照組作比較，p<0.001；圖5顯示各組裸鼠在被口服投藥以本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物之後，牠們的腹部中的腫瘤體積隨著時間的變化，其中病理對照組表示被注射以人類膀胱癌細胞株T24的裸鼠；實驗組1與2表示被注射以人類膀胱癌細胞株T24以及被口服投藥以本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物(劑量分別為5mg/kg以及10mg/kg)的裸鼠；圖6顯示在開始投藥之後的第10週結束之時，從各組裸鼠的腹部中所取出的腫瘤的重量，其中病理對照組表示被注射以人類膀胱癌細胞株T24的裸鼠；實驗組1與2表示被注射以人類膀胱癌細胞株T24以及被口服投藥以本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物(劑量分別為5mg/kg以及10mg/kg)的裸鼠；以及“＊＊＊”表示：當與病理對照組作比較，p<0.001；圖7是一組織切片染色圖，其顯示在開始投藥之後的第10週結束之時，從各組裸鼠的腫瘤中所取得的組織藉由蘇木精-伊紅染色而被觀察到的結果；以及圖8顯示在開始投藥之後的第10週結束之時所取得的實驗組2以及病理對照組的裸鼠的腫瘤組織切片之TUNEL-DAPI雙重染色結果，其中出現有綠色螢光標記之處即表示有細胞凋亡(apoptosis)發生，而被DAPI染色之處則為藍色。
【實施方式】較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例
一般實驗材料：
1.細胞株的來源與培養：
在下面的實施例中所使用的人類膀胱癌細胞株(human bladder cancer cell line)T24(BCRC 60062)是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)；人類膀胱癌細胞株J82是由國立中山大學的薛佑玲教授所提供；以及人類膀胱上皮細胞E7(human bladder epithelial cell E7)[它是一種經人類乳突病毒E7-不朽化(Human papillomavirus E7-immortalized)的細胞株]是由國立成功大學的劉校生教授所提供。
這3種細胞分別依照下面表1所示的培養基以及培養條件而被培養於10-cm培養皿(10-cm petri dish)中，並在培養箱中進行培養。之後，大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約85%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline,PBS)來清洗細胞共計1次，接著加入胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養瓶中，並在培養箱中進行培養。
2.在下面的實施例中所使用的雌性BALB/cAnN.Cg-Foxnlnu/CrlNarl裸鼠(nude mouse)(五週大，平均體重約20g)是購自於國家實驗研究院實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)。所有的實驗動物被飼養於一個室溫維持在20-26℃以及相對濕度維持在50±10%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的處理以及一切實驗程序均符合國際實驗動物管理標準。
一般實驗方法：
1.統計學分析(Statistical analysis)：
在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，所得到的實驗數據是採用Sigma Plot統計軟體(version 12.0,Systat Software Inc.)來進行統計分析，並以平均值±標準偏差(Standard Deviation,S.D.)來表示。所有的數據是藉由史徒登氏t-試驗(Student’s t-test)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p<0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。
實施例1. 製備紅石榴果實的脂溶性萃取物(preparation of lipid soluble extract of Punica granatum L.fruits)
首先，將採集於屏東縣九如鄉的新鮮的紅石榴果實(Punica granatum L.fruits)(2102.08g)(包括果皮、果肉以及種籽)切碎並將之與100%乙醇(ethanol)以一為1：3(w/v)的比例進行混合，接著將所得到的混合物置於一果汁機中進行攪拌以及破碎處理，繼而在室溫下靜置歷時24小時，之後以一孔徑為300mm的1號濾紙(LOT NO.10606010,ADVANTEC)來進行過濾，而得到一濾液。另外，令所形成的殘餘物(residue)與100%乙醇在一為1：3(w/v)的比例下進行浸泡，繼而在室溫下靜置歷時24小時，之後以該1號濾紙來進行過濾並收集濾液。上述殘餘物的浸泡-靜置-過濾步驟被重複進行4次。接著，收集所有的濾液並以減壓濃縮的方式來移除乙醇，藉此而得到一紅石榴果實的乙醇萃取物(379.8g)。
將所得到的紅石榴果實的乙醇萃取物(379.8g)溶於1500mL的RO水中，之後加入1500mL的乙酸乙酯(ethyl acetate,EtOAc)並在室溫下進行分配分離(partitioning)歷時24小時，繼而收取乙酸乙酯層(EtOAc layer)。另外，將所形成的水性層(aqueous layer)加入1500mL的乙酸乙酯，然後依據上述來進行乙酸乙酯的分配分離步驟。此乙酸乙酯的分配分離步驟被重複進行6次。接著，收集所有的乙酸乙酯層並以減壓濃縮的方式來移除乙酸乙酯，藉此而得到一呈黃色固態狀的紅石榴果實的脂溶性萃取物(24.4399g)。
實施例2. 紅石榴果實的脂溶性萃取物的高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)分析
為瞭解本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物的主要成份分佈，依據上面實施例1所得到的紅石榴果實的脂溶性萃取物被拿來進行高效能液相層析分析。
實驗材料：
為供比較，申請人依據習知方法來製備一種紅石榴果汁的萃取物(以下簡稱為習知的紅石榴果汁的萃取物)，並將它拿來進行相同的HPLC分析。有關該習知的紅石榴果汁的萃取物是依據Song-Tay Lee et al.(2013)(同上述)當中所述的方法來進行。簡言之，將新鮮的紅石榴果實去除果皮(peeled)，接著將可食用部分拿來進行一擠壓處理，而得到一紅石榴果汁。之後，將該紅石榴果汁進行冷凍乾燥(freeze dried)，接而以乙酸乙酯予以萃取歷時16小時，繼而以10,000g來進行離心歷時10分鐘，之後移除上澄液並收集所形成的殘餘物。接著，將該殘餘物以70%乙醇進行萃取歷時24小時，藉此而得到該習知的紅石榴果汁的萃取物。
為供進行HPLC分析，在上面實施例1中所得到的紅石榴果實的脂溶性萃取物被溶於100%甲醇中以配製成一具有一濃度為2.94mg/mL的待測溶液樣品，而該習知的紅石榴果汁的萃取物被溶於水中以配製成一具有一濃度為2.9mg/mL的待測溶液樣品。由此所得到的該等待測溶液樣品被拿來進行下面的HPLC分析。
實驗方法：
本實驗所使用的HPLC分析儀器如下：HITACHI 2000系列液相層析系統(HITACHI 2000 series liquid chromatography system)(HITACHI)以及L-2450二極體陣列偵測器(L-2450 Diode Array Detector)(HITACHI)。而有關HPLC的各項操作參數與條件被顯示於下面的表2中。
結果：
圖1顯示將依據上面實施例1所製得的紅石榴果實的脂溶性萃取物拿來進行高效能液相層析所得到的洗提圖形(elution profile)。從圖1可見，本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物在第0至60分鐘的滯留期間出現有6個主要的洗提波峰(分別被標示為波峰a1、a2、a3、a4、a5以及a6)。
圖2顯示將依據Song-Tay Lee et al.(2013)(同上述)所製得的習知的紅石榴果汁的萃取物拿來進行高效能液相層析所得到的洗提圖形。從圖2可見，該習知的紅石榴果汁的萃取物在第0至60分鐘的滯留期間出現有1個主要的洗提波峰(被標示為波峰b1)。
經由比對圖1與圖2的波峰位置可清楚地發現，依據本發明所得到的紅石榴果實的脂溶性萃取物的成份是明顯不同於依據習知方法所得到的紅石榴果汁的萃取物所具者。
實施例3. 紅石榴果實的脂溶性萃取物的細胞可活性分析(cell viability analysis)
依據上面實施例1所得到的紅石榴果實的脂溶性萃取物被拿來進行下面的細胞可活性分析，俾以評估該紅石榴果實的脂溶性萃取物的細胞毒性(cytotoxicity)。
實驗材料：
1.製備紅石榴果實的脂溶性萃取物的儲備溶液(stock solution)：
將上面實施例1中所得到的紅石榴果實的脂溶性萃取物溶於二甲亞碸(dimethylsulfoxide,DMSO)中以配製成一具有一濃度為100mg/mL的儲備溶液備用。
實驗方法：
首先，E7細胞被分成2組，其中包括1個對照組(control)以及1個實驗組。另外，T24細胞以及J82細胞各自被分成7組，其中包括1個對照組以及6個實驗組(亦即實驗組1至6)。將各組細胞分別以一為1×104細胞/井的數量培養於含有200μL的細胞培養基(有關各個細胞所使用的培養基是如上面表1中所述者)的96-井培養盤(96-well plate)中，並在培養箱(有關各個細胞的培養條件的設定是如上面表1中所述者)中進行培養歷時16小時。接著，將適量之依據上面“實驗材料”的第1項所製得的紅石榴果實的脂溶性萃取物的儲備溶液添加至各個實驗組中，而使得E7細胞的實驗組具有一最終濃度為5μg/mL的紅石榴果實的脂溶性萃取物，以及使得T24細胞以及J82細胞的實驗組1至6分別具有一最終濃度為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL以及200μg/mL的紅石榴果實的脂溶性萃取物。至於對照組的細胞則被添加以適量的DMSO至一最終濃度為2μL/mL。
另外，為供比較，依據上面實施例2所製得的習知的紅石榴果汁的萃取物亦被拿來進行實驗並參照上面方法中針對T24細胞所描述的步驟來進行細胞的分組、培養與投藥。
各組細胞培養物在培養箱中進行培養歷時72小時後，移除各井中的液體，接著加入20μL的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴化物{3-[4,5-dimethylthiazol-2-y1]-2,5-diphenyltetrazolium bromide}(MTT，5mg/mL，配於PBS)並予以培養歷時4小時。之後，移除各井中的液體，繼而加入0.1mL的DMSO並予以混合均勻，然後於540nm的波長下以一波長酵素免疫分析儀(PowerWave XS，BioTek)來讀取各井的吸光值(OD540)。
細胞可活性百分比(%)是藉由將所測得的吸光值(OD540)代入下列公式(1)而被計算出：公式(1)：A=(B/C)×100
其中：A=細胞可活性百分比(%)
B=各組所測得的OD540吸光值
C=對照組所測得的OD540吸光值
有關本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物以及習知的紅石榴果汁的萃取物抑制50%人類膀胱癌細胞株T24生長的濃度(50% inhibition concentration,IC50)是藉由計算待測萃取物會降低細胞可活性達50%(與對照組的細胞相較之下)的濃度而從曲線的線性部份被測定出。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果：
圖3顯示人類膀胱上皮細胞E7在以不同濃度的紅石榴果實的脂溶性萃取物予以處理後所測得的細胞可活性百分比。從圖3可見，實驗組的細胞可活性百分比相較於對照組所具者並沒有顯著的差異性。這個實驗結果顯示：本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物不會對人類膀胱上皮細胞E7造成傷害。
圖4顯示人類膀胱癌細胞株T24與J82在分別以不同濃度的紅石榴果實的脂溶性萃取物予以處理後所測得的細胞可活性百分比。從圖4可見，無論是人類膀胱癌細胞株T24或J82，在與對照組相較之下，實驗組1至6的細胞可活性百分比都有顯著的降低，同時會隨著紅石榴果實的脂溶性萃取物之濃度的增加而更趨於明顯。這個實驗結果顯示：本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物對於人類膀胱癌細胞具有細胞毒性。
下面表3顯示本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物以及習知的紅石榴果汁的萃取物分別對於人類膀胱癌細胞株T24的50%抑制濃度(IC50)。從表3可見，本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物能有效地抑制人類膀胱癌細胞株T24的生長，並且展現出一要比習知的紅石榴果汁的萃取物更為優異的抗膀胱癌活性。
實施例4. 紅石榴果實的脂溶性萃取物在活體內(in vivo)抑制人類膀胱癌細胞株T24生長上的效用評估
在本實施例中，申請人使用人類膀胱癌細胞株T24來誘發裸鼠產生腫瘤，並且藉由腫瘤體積與腫瘤重量的測量、組織病理學檢驗(histopathological examination)以及末端去氧核糖核苷酸轉移酶調節的dUTP切口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)分析來評估本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物在活體內的抗癌效用。
實驗方法：
A、腫瘤體積與腫瘤重量的測量：
將人類膀胱癌細胞株T24以一為1×107細胞的數量加入至250μL的無血清培養基(serum free medium,SFM)中，繼而加入250μL的基質膠(Matrigel)(Cat NO.354248,BD Biosciences)並予以混合均勻。接著，將所得到的混合物分別皮下注射至各個待試驗裸鼠的右側腹部的皮下組織中(亦即，每個待試驗裸鼠分別被注射以500μL的含有1×107癌細胞的混合物)，俾以誘發腫瘤生成。在進行皮下注射之後的第24小時之時，將待試驗裸鼠隨機地分成1個病理對照組(pathological control)(n=11)以及2個實驗組[亦即實驗組1(n=10)以及實驗組2(n=10)]。各組的裸鼠藉由使用一胃管灌食針來進行口服投藥，其中實驗組1與2的裸鼠被口服投藥以本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物(配於無菌二次水中，劑量分別為5mg/Kg以及10mg/Kg)，而病理對照組的裸鼠被口服投藥以200μL的無菌二次水。之後，各組小鼠依照上述方式每天被投藥1次，投藥時間總共歷時10週。
在開始投藥之後的第1週結束之時，紀錄裸鼠的體重以及以卡尺(caliper)來量測裸鼠腹部腫瘤的長度與寬度。之後，每隔1週依照上述方式對各組小鼠進行體重與腫瘤大小的紀錄與量測，並且持續直至第10週結束。
腫瘤體積(tumor volume)是藉由將所測得的腫瘤的長度與寬度代入下列公式(2)而被計算出：公式(2)：D=(E×F2)/2
其中：D=腫瘤體積(mm3)
E=腫瘤的長度(mm)
F=腫瘤的寬度(mm)
在開始投藥之後的第10週結束之時，藉由胺甲酸乙酯(urethane)來犧牲各組的裸鼠，接著取出各組裸鼠的腫瘤並量測其重量，繼而將部分腫瘤拿來進行下面第B項的分析。另外，將實驗組2以及病理對照組的裸鼠的部分腫瘤拿來進行下面第C項的分析。
B、組織病理學檢驗：
對上面第A項當中所得到的各組裸鼠的部分腫瘤各取具有一體積為0.4cm3的組織樣品，並在室溫下以10%福馬林(formaline)來進行固定處理(fixation)歷時24小時，繼而將經固定的組織樣品以石蠟(paraffin)予以包埋(embedding)，然後進行切片處理，藉此而得到具有一厚度為3μm的組織切片(tissue sections)。
之後，所得到的組織切片藉由使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)並且依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行染色，經染色的組織切片是藉由使用正立式螢光顯微鏡(AxioImagerA1,ZEISS)並在一為400倍的放大倍率下來進行觀察以及拍照。
C、TUNEL分析：
對上面第A項當中所得到的實驗組2以及病理對照組的裸鼠的部分腫瘤各取具有一體積為0.4cm3的組織樣品，並在室溫下以10%福馬林來進行固定處理歷時24小時，繼而予以石蠟包埋以及切片(厚度為3μm/片)。在脫蠟之後，使用一ApoAlertTM DNA片段分析套組(ApoAlertTM DNA Fragmentation Assay Kit,Cat NO.630108,Clotech)並依照廠商所提供的操作指引來對切片進行TUNEL染色(呈現綠色)，接而以4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)予以對比染色(counter-stained)(呈現藍色)。螢光染色結果是藉由使用正立式螢光顯微鏡(AxioImagerA1,ZEISS)而在一為200倍的放大倍率下被觀察，其中被顯示出有綠色螢光標記[亦即TUNEL陽性(TUNEL positive)]之處即表示有細胞凋亡發生，而完整的細胞則被DAPI染成藍色。
結果：
A、腫瘤體積與腫瘤重量的測量：
圖5顯示各組裸鼠在被口服投藥以本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物之後，牠們的腹部中的腫瘤體積隨著時間的變化。從圖5可見，病理對照組的裸鼠的腫瘤體積會在第3週之後隨著時間而逐漸地增大，而實驗組1與2的裸鼠的腫瘤體積會隨著時間而逐漸地減小。
圖6顯示在開始投藥之後的第10週結束之時，從各組裸鼠的腹部中所取出的腫瘤的重量。從圖6可見，在與病理對照組相較之下，實驗組1與2的裸鼠的腫瘤重量皆有顯著的降低。這個實驗結果顯示：本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物可以有效地抑制腫瘤的生長，進而減少腫瘤的重量。
B、組織病理學檢驗：
圖7是一組織切片染色圖，其顯示在開始投藥之後的第10週結束之時，從各組裸鼠的腫瘤中所取得的組織藉由蘇木精-伊紅染色而被觀察到的結果。從圖7可見，在與病理對照組相較之下，實驗組1與2的裸鼠的腫瘤組織切片中所觀察到的癌細胞數量有明顯地減少。這個實驗結果顯示：本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物可以有效地抑制癌細胞的增生。
C、TUNEL分析：
圖8顯示在開始投藥之後的第10週結束之時所取得的實驗組2以及病理對照組的裸鼠的腫瘤組織切片之TUNEL-DAPI雙重染色結果。從圖8可見，在與病理對照組相較之下，實驗組2的裸鼠的腫瘤組織切片當中出現有大量的凋亡細胞。這個實驗結果顯示：本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物會誘發人類膀胱癌細胞株T24進行細胞凋亡，進而促使癌細胞死亡並抑制癌細胞的生長。
綜合以上的實驗結果可知：依據本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物會對人類膀胱癌細胞產生細胞毒性，並且能夠有效地抑制癌細胞增生以及誘發癌細胞的細胞凋亡。因此，申請人認為：依據本發明的紅石榴果實的脂溶性萃取物具有發展成為一抗膀胱癌藥物的高潛力。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。