【技術領域】發明領域
本發明是有關於使用一經由粉擬青黴菌(Paecilomyces farinosus)G30801的培育(cultivation)而得到的產物來治療第1型或第2型糖尿病(Type 1 or Type 2 diabetes mellitus)，其中該粉擬青黴菌G30801以寄存編號(accession number)BCRC 930108被寄存(deposited)於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。
【先前技術】發明背景
糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種與許多組織的嚴重代謝不平衡(serious metabolic imbalances)以及非生理性改變(non－physiological changes)有關聯的病理狀況(pathologic condition)，它的症狀包括不正常的高血糖(abnormally high blood sugar)[亦即高血糖症(hyperglycemia)]、多食症(polyphagia)、多尿症(polyuria)以及多渴症(polydipsia)。一般而言，糖尿病可被分類為第1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)[亦被稱為胰島素－依賴型糖尿病(insulin－dependent diabetes)或幼年型糖尿病(juvenile diabetes)]以及第2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)[亦被稱為非胰島素－依賴型糖尿病(non－insulin－dependent diabetes)或成年型糖尿病(adult diabetes)]。
T1DM是一種自體免疫疾病(autoimmune disease)，它會使生產胰島素的胰臟β細胞(insulin－producing pancreatic β cells)受到永久性破壞而廢除(abolish)內生性胰島素(endogenous insulin)的生成。T1DM大多發生於幼年時期(childhood)或青少年時期(adolescence)並且通常在30歲以前會被檢測出。帶有T1DM的病患典型地具有高血糖症，若未予以妥善治療，可能會引起糖尿病酮酸症(diabetic ketoacidosis)而造成昏迷(coma)或死亡。T1DM的治療方法包括胰島素替代療法(insulin replacement therapy)[亦即外生性胰島素(exogenous insulin)的注射]或胰臟(pancreas)/胰島細胞(islet cell)的移植(transplantation)。
T2DM是一種具有複雜的致病機制(pathogenesis)的異質性疾病(heterogeneous disease)，該致病機制與基因易感性(genetic susceptibility)和生活方式(life style)(特別是飲食方式)有關(F.Zhanget al.(2003),Exp.Anim.,52：401－407)。T2DM通常發生於40歲以上的成年人(特別是體重過重的成年人)，而體重過重的幼兒或青少年亦可能患有此種類型的糖尿病。與T1DM相較之下，T2DM的症狀較輕微並且幾乎不會造成酮酸症(ketoacidosis)或昏迷。T2DM的症狀包括高血糖症、接近正常的胰島素位準(near normal insulin levels)、不同程度的胰島素抗性(insulin resistance)以及輕微地增加的升糖素(glucagons)位準。
糖尿病的慢性併發症(chronic complications)包括心血管疾病(cardiovascular disease)的加速發展、末期腎臟病(end－stage renal disease)、視力喪失(visual loss)以及截肢(limb amputations)。所有的這些併發症促成在帶有糖尿病的人們中之過度的發病率(morbidity)與死亡率(mortality)。這些併發症的處理對社會造成一龐大的財政負擔。
蟲生病原真菌(entomopathogenic fungi)[或被稱為蟲生真菌(entomogenous fungi)]是一種寄生於昆蟲的真菌，它們對於昆蟲具有很高的宿主專一性(host specificity)而不會感染昆蟲以外的動物或植物。蟲生病原真菌的感染途徑主要是以顯微孢子(microscopic spores)[通常為無性的(asexual)、有絲分裂孢子的分生孢子(mitosporic conidia)]的形式附著至昆蟲的外殼表面(external body surface)。在適當的溫度以及溼度(moisture)(通常為高溼度)下，存在於昆蟲的外殼表面上的孢子會發芽(germinate)形成菌絲(hyphae)，而這些菌絲會穿透(penetrate)昆蟲的角質層(cuticle)並到達昆蟲的體腔(body cavity)[亦即血腔(hemocoel)]內。侵入的菌絲會利用昆蟲體內的營養來進行生長與增殖(multiplication)，進而使昆蟲體內的組織器官受到破壞並導致昆蟲死亡。
蟲生病原真菌被廣為知曉的用途是供作為農業上的生物殺蟲劑(biological insecticides)。此外，某些蟲生病原真菌被發現在醫療用途上具有極大的發展價值，而這當中較為常見和/或重要的蟲生病原真菌包括：(1)冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis)，它是屬於子囊菌門(Ascomycota)、核菌綱(Pyrenomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、冬蟲夏草屬(Cordyceps)；以及(2)粉擬青黴菌(Paecilomyces farinosus)，它是屬於子囊菌門、子囊菌綱(Ascomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、髮菌科(Trichocomaceae)、擬青黴屬(Paecilomyces)。
冬蟲夏草菌是一種被廣為使用的傳統中草藥(chinese herbal medicine,CHM)，它會寄生於鱗翅目(Lipidoptera)、蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆蟲的幼蟲(larvae)。已知冬蟲夏草菌具有抗心律不整(anti－cardiac arrhythmia)、促進血管擴張(hemangiectasis)、抗氧化(antioxidant)、抗腫瘤(antitumor)以及免疫調節(immunoregulation)等功效。另外，從冬蟲夏草菌的培養菌絲體(cultured mycelium)的萃取物(extracts)所分離出的多糖(polysaccharide)(諸如CS－F30或CS－F10)亦被證實具有降血糖的活性(hypoglycemic activity)，能夠顯著地降低正常小鼠、鏈佐黴素(STZ)－誘發的糖尿病小鼠[streptozotocin(STZ)－induced diabetic mice]以及腎上腺素－誘發的高血糖小鼠(epinephrine－induced hyperglycemic mice)的血漿葡萄糖位準(plasma glucose level)(T.Kihoet al.(1996),Biol.Pharm.Bull.,19：294－296；T.Kihoet al.(1999),Biol.Pharm.Bull.,22：966－970)。
粉擬青黴菌[亦即蟲草棒束孢(Isaria farinosa)]具有高度的殺蟲致病性(insecticidal virulence)，它主要寄生於鱗翅目(Lipidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)以及膜翅目(Hymenoptera)昆蟲的幼蟲。據報導，從粉擬青黴菌的發酵培養物所分離出的多糖或生物活性代謝物(bioactive metabolites)具有顯著的抗腫瘤以及抗氧化的效用(G.Langet al.(2005),Ｊ.Nat.Prod.,68：810－811；Y.H.Jianget al.(2005),Journal of Food Biochemistry,29：323－335；Y.H.Jianget al.(2008),Microbiological Research,163：424－430)。
在南台科技大學生物科技研究所(Institute of Biotechnology,Southern Taiwan University)的張于仁所著碩士論文[名稱：“蟲草屬真菌之生物活性物質對癌細胞之影響(Effect of the bioactive metabolites ofCordyceps sp.fungus on the cancer cell)”]中，張于仁使用含有不同碳源(carbon source)與氮源(nitrogen source)的液態培養基來進行粉擬青黴菌的發酵培養，並探討所獲得的粉擬青黴菌發酵液在抑制下列癌細胞的生長上的能力：人類肺腺癌細胞A549(human lung adenocarcinoma cells A549)、人類子宮頸上皮癌細胞HeLa(human cervical epithelioid carcinoma cells HeLa)、人類肝母細胞瘤細胞HepG2(human hepatoblastoma cells HepG2)以及人類乳腺癌細胞MCF7(human breast adenocarcinoma cells MCF7)。
在南台科技大學生物科技研究所的黃美員所著碩士論文[名稱：“冬蟲夏草分離菌株蛋白質圖譜與抗癌活性之探討(Investigation of the proteome maps and anti－cancer activities of isolated strain ofCordyceps sinensis)”]中，黃美員使用不同的液態培養基(liquid medium)(分別以葡萄糖、蔗糖、果糖或麥芽糖作為碳源)或不同的固態培養基(solid medium)[分別以大豆(soybean)或黑豆(black bean)作為基質]來進行粉擬青黴菌G308－1的發酵培養，並對所收獲的菌絲體(mycelia)進行蛋白質圖譜分析。該篇碩士論文亦探討液態或固態發酵培養所獲得的粉擬青黴菌G308－1菌絲體的水萃取液(water extract liquid)或酒精萃取液(alcohol extract liquid)在抑制下列癌細胞的生長上的能力：人類子宮頸癌細胞HeLa(human cervical cancer cells HeLa)、人類乳癌細胞MCF－7(human breast cancer cells MCF－7)、人類前列腺癌細胞DU－145(human prostate cancer cells DU－145)以及人類肝癌細胞HepG2(human hepatoma cells HepG2)。
在南台科技大學生物科技研究所的熊起輝所著碩士論文[名稱：“粉擬青黴菌菌絲體抑制人類肝癌細胞株HepG2生長之分子機制探討(Studies on the molecular mechanism of the cell cycle arrest and apoptosis in human HepG2 cell line by hot－water extracts fromPaecilomyces farinosusmycelium)”]中，熊起輝使用大豆作為基質來進行粉擬青黴菌菌絲體的固態發酵培養，並探討所收獲的粉擬青黴菌菌絲體的水萃取物(Paecilomyces farinosusmycelia water extract,PFW)在抑制人類肝癌細胞HepG2生長上的分子與生理學機制(molecular and physiological mechanism)。實驗結果顯示，粉擬青黴菌菌絲體的水萃取物會讓HepG2細胞的細胞週期(cell cycle)遲滯(arrest)在G0/G1期(G0/G1 phase)，並且藉由活化HepG2細胞內的硫胱胺酸蛋白酶－9(Caspase－9)與硫胱胺酸蛋白酶－3(Caspase－3)來進行一連串的細胞內訊息分子傳遞(intracellular signal molecule transduction)，進而誘發細胞凋亡(apoptosis)。
在一個先前研究中，李松泰等人以含有米的固態培養基來培養粉擬青黴菌G30801，並探討所收獲的菌絲體的熱水萃取物(hot－water extract,HW)在活化RAW264.7細胞上的效用。實驗結果發現，HW顯著地增加RAW264.7細胞中的IL－1、IL－6的mRNA位準以及蛋白質表現，這顯示HW可能藉由活化巨噬細胞(macrophage)而在免疫系統(immune system)上具有向上調節(up－regulation)的活性(S.T.Leeet al.(2007),The 22thJoint Annual Conference of Biomedical Science：P503,page 107)。
經研究，申請人意外地發現粉擬青黴菌G30801的發酵產物(fermentation product)除了具有抑制腫瘤/癌細胞生長的能力之外，還具有降低血糖位準的能力。因此，該菌株的發酵產物被預期可供用來治療第1型或第2型糖尿病。
【發明內容】發明概要
於是，本發明提供一種用於治療第1型或第2型糖尿病的藥學組成物，其包含有一經由粉擬青黴菌(Paecilomyces farinosus)G30801的培育而得到的產物，其中該粉擬青黴菌G30801以寄存編號BCRC 930108被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。
本發明亦提供一種用以治療一具有或被懷疑具有第1型或第2型糖尿病的個體的方法，其包括對該個體投藥一經由粉擬青黴菌G30801的培育而得到的產物。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
發明的詳細說明
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。
在開發可用於治療第1型或第2型糖尿病的藥物上，申請人發現：粉擬青黴菌(Paecilomyces farinosus)G30801具有這方面的產業應用潛力。於是，本發明揭示粉擬青黴菌G30801供應用於製備一用來治療第1型或第2型糖尿病的醫藥品的用途。
粉擬青黴菌G30801已於西元2008年1月22日以寄存編號BCRC 930108被寄存於食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。
依據本發明，粉擬青黴菌G30801的培育可以藉由將粉擬青黴菌G30801的一個菌絲體接種物(mycelial inoculum)引至一固態培養(solid culture)或液態培養(liquid culture)來進行。
如此處所用的，術語“培育(cultivation)”、“培養(culturing)”以及“發酵(fermentation)”可被交換地使用。
依據本發明，當採用固態培養來培育粉擬青黴菌G30801時，可以使用一包含有下列至少一者的固態培養基來進行：米(rice)、大豆(soybean)、黑豆(black bean)、小麥(wheat)、大麥(barley)、黑麥(rye)、蕎麥(buckwheat)、燕麥(oat)、玉米(corn)、薏仁(job’s tears)、山藥(yam)、馬鈴薯(potato)、甘藷(sweet potato)、樹薯(cassava)、芋頭(taro)、葛鬱金(arrowroot)、蓮(lotus plants)、蘑芋(elephant foot)、食用美人蕉(edible canna)、菊芋(Canada potato)、高粱(sorghum)、蠶蛹(silkworm chrysalis)、麩皮(wheat bran)以及米糠(rice bran)。
在本發明的一個較佳具體例中，該固態培養是使用一包含有下列至少一者的固態培養基來進行：米、大豆以及黑豆。在本發明的一個更佳具體例中，該固態培養是使用一包含有米的固態培養基來進行。
依據本發明，該固態培養基可進一步包含有一選自下列群組中的氮源(nitrogen source)：(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、尿素(urea)、蛋白腖(peptone)、胰化蛋白腖(tryptone)、肉類萃取物(meat extract)、酵母萃取物(yeast extract)、酵母粉(yeast powder)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該固態培養基進一步包含有蛋白腖。
依據本發明，該固態培養基可進一步包含有一選自下列群組中的無機鹽(inorganic salts)：K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、MnSO4、FeCl3、NaHCO3、MgCl2、FeSO4，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該固態培養基進一步包含有KH2PO4。
此外，依據本發明，該固態培養基也可被配製成含有粉擬青黴菌生長所需的養分的瓊脂培養基(agar medium)，有關瓊脂培養基的配製，這落在熟習此項技術人士的專業素養與例行技術範疇內。例如，該瓊脂培養基可以使用將於下面說明的碳源(carbon source)、氮源與無機鹽等物質來配製。
依據本發明，當採用液態培養來培育粉擬青黴菌G30801時，可以使用一選自下列的液態培養基來進行：合成培養基(synthetic medium)，以及含有一天然物質(natural material)的半合成培養基(semi－synthetic medium)。
當該液態培養基是一合成培養基時，它的化學配方可以包含有適於粉擬青黴菌生長的碳源以及氮源。
依據本發明，適用於配製該合成培養基的碳源包括，但不限於：葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、麥芽糖(maltose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、海藻糖(trehalose)、澱粉(starch)、糖蜜(molasses)、馬鈴薯澱粉(potato starch)、玉米澱粉(corn starch)以及麥芽萃取物(malt extract)等等。在本發明的一個較佳具體例中，該合成培養基被配方為含有馬鈴薯澱粉。
依據本發明，適用作為配製該合成培養基的氮源包括，但不限於：(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、酪蛋白胺基酸、尿素、蛋白腖、胰化蛋白腖、肉類萃取物、酵母萃取物以及酵母粉等等。在本發明的一個較佳具體例中，該合成培養基被配方為含有酵母萃取物。
依據本發明，該合成培養基可進一步包含有一選自下列群組中的無機鹽：K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、MnSO4、FeCl3、NaHCO3、MgCl2、FeSO4，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該合成培養基進一步包含有MgSO4以及KH2PO4。
當該液態培養基是一含有一天然物質的半合成培養基時，適用於本發明的天然物質包括，但不限於：大豆粉(soybean flour)、黑豆粉(black bean meal)、小麥粉(wheat meal)、大麥粉(barley meal)、黑麥粉(rye flour)、蕎麥粉(buckwheat flour)、燕麥粉(oat meal)、玉米粉(corn flour)、薏仁粉(job’s tears flour)、山藥粉(yam flour)、馬鈴薯粉(potato flour)、甘藷粉(sweet potato flour)、樹薯粉(cassava flour)、芋頭粉(taro flour)、豆餅(bean cake)、豆粕(bean meal)、大豆蛋白萃取物、花生餅(peanut cake)、玉米粉(maize flour)、米糠(rice bran)、酒糟(vinasse)、蠶蛹粉(silkworm pupa meal)、魚粉(fish meal)、奶粉(milk powder)、酵母粉(yeast powder)以及玉米浸出液(corn steep liquor)等等。
依據本發明，該半合成培養基可進一步包含有一選自下列群組中的碳源：葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、澱粉、甘露糖、海藻糖、糖蜜、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉、麥芽萃取物，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該半合成培養基進一步包含有馬鈴薯澱粉。
依據本發明，該半合成培養基可進一步包含有一選自於下列群組中的無機鹽：K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、MnSO4、FeCl3、NaHCO3、MgCl2、FeSO4，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該半合成培養基進一步包含有MgSO4以及KH2PO4。
在本發明的一個較佳具體例中，該經由粉擬青黴菌G30801的液態培養而得到的產物包含有從液態培養之後的液態培養基所分離出的粉擬青黴菌G30801菌絲體。在本發明的另一個較佳具體例中，該經由粉擬青黴菌G30801的液態培養而得到的產物包含有從液態培養之後的液態培養基所分離出之一不含有菌絲體的流體。
依據本發明之經由粉擬青黴菌G30801的培育而得到的產物(包括經由固態培養以及液態培養而得到的產物)，已被證實對於帶有第1型或第2型糖尿病的大鼠皆具有降低血糖位準的效用。特別地，相較於目前臨床上被應用於降血糖的藥物(hypoglycemic drugs)[例如，滅糖尿(Minidiab)與迪化糖(Diaformin)]，從粉擬青黴菌G30801的液態培養之後的液態培養基所分離出的不含有菌絲體的流體被證實可以更有效地降低帶有第2型糖尿病的大鼠之血糖位準。
因此，本發明提供一種用於治療第1型或第2型糖尿病的藥學組成物，其包含有一經由粉擬青黴菌G30801的培育而得到的產物。
依據本發明的藥學組成物可利用熟習此藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地、局部地或口服地投藥的劑型，這包括，但不限於，注射品(injection)(例如，無菌的水溶液或分散體)、無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)以及類似之物。
依據本發明的藥學組成物可以一選自於下列所構成的群組中的非經腸道途徑來投藥：腹腔注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)以及靜脈內注射(intravenous injection)。
在本發明的一個較佳具體例中，該藥學組成物被製成適於以靜脈內注射被投藥的劑型。
在本發明的另一個較佳具體例中，該藥學組成物被製成適於口服投藥的劑型。
依據本發明的藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑、吸收延遲劑、脂質體以及類似之物。
在本發明的一個較佳具體例中，該藥學組成物包含有一藥學上可接受的溶劑，而且該溶劑是下列的任一者：水、生理鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水、含糖溶液以及含有醇的水性溶液。在本發明的一個較佳具體例中，該溶劑是水。
本發明亦提供一種用以治療一具有或被懷疑具有第1型或第2型糖尿病的個體的方法，其包括對該個體投藥一經由粉擬青黴菌G30801的培育而得到的產物。
依據本發明，經由粉擬青黴菌G30801的培育而得到的產物之投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的藥學組成物的每日投藥劑量通常是25 mg/Kg體重至50 mg/Kg體重，呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被非經腸道地、口服地或局部地投藥。
【實施方式】較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例
A、實驗材料：1.實驗動物：在下面實驗中所使用的雄性遠交系Wistar大鼠(male outbred Wistar rats)(8週大，體重約為250±20 g)是得自於國家實驗研究院實驗動物中心(National Applied Research Laboratories National Laboratory Animal Center)。這些實驗動物被隨機地分成正常組(n＝40)以及糖尿病組(n＝130)，其中正常組大鼠在整個實驗過程中被餵食以一般飼料(normal diet)[它含有60%碳水化合物(carbohydrate)、28%蛋白質(protein)以及12%脂質(lipid)]，而糖尿病組大鼠在整個實驗過程中被餵食以高脂肪飼料(high fat diet)[它是藉由將每公斤的一般飼料添加以140 g之含有23%飽和脂肪酸(saturated fatty acids)與77%不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids)的豬油(lard oil)而被製成]。所有的實驗動物被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在22℃以及濕度維持在75%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的處理以及一切實驗程序均依據國立東華大學(National Dong－Hwa University)的「實驗動物飼養管理及使用規範」(“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”)來進行。
2.粉擬青黴菌G30801的菌絲體接種物的製備：將粉擬青黴菌G30801接種於一馬鈴薯右旋糖肉湯培養基(potato dextrose broth,PDB)(Himed,M096)中，並於一恆溫振盪培養箱(17℃、100 rpm)內進行培養歷時7天。所形成的培養物(the resulting culture)被使用作為下面實施例中的粉擬青黴菌G30801菌絲體接種物。
B、一般實驗方法：1.血糖濃度分析(blood glucose concentration analysis)：在下面的實驗中，大鼠的血糖濃度分析是使用血糖測試條(blood glucose test strip)(Ascensia Elite Blood Glucose Test Strips,Bayer Incorporation,Toronto,Ont.,Canada)以及血糖儀(blood glucose meter)(Glucometer Elite XL,Bayer Incorporation,Toronto,Ont.,Canada)並參照Glucometer Elite XL的使用者指南(User Guide)中所描述的操作程序來進行。主要地，將該血糖測試條插入至該血糖儀中，接著將2 μL的大鼠血液滴入至該血糖測試條的測試端(test end)並予以靜置30秒後，即可由該血糖儀讀取測試結果。
2.第1型或第2型糖尿病的誘發(Induction of Type 1 or Type 2 diabetes mellitus)：有關於第1型或第2型糖尿病的誘發是參考F.Zhanget al.(2003),Exp.Anim.,52：401－407當中所述的方法來進行，並作部分修改。首先，將鏈佐黴素(streptozotocin,STZ)(Merck)溶於0.1 M檸檬酸緩衝液(citric acid buffer)(pH 4.5)中以配製具有一濃度為30 mg/mL的STZ溶液。在經歷2個月的高脂質飼料餵食之後，將STZ溶液(劑量為30 mg/kg)腹腔注射(intraperitoneal injection)至糖尿病組大鼠體內。另外，在經歷2個月的一般飼料餵食之後，將0.1 M檸檬酸緩衝液(pH 4.5)(劑量為1 mL/kg)腹腔注射至正常組大鼠體內。
為了確認STZ會誘發大鼠產生高血糖症(hyperglycemia)，在STZ溶液的腹腔注射之後的第17天進行下面的葡萄糖耐受性試驗(glucose tolerance test)。在經歷15小時的禁食(fasting)後，藉由靜脈穿刺採血(venipuncture bleeding)而從正常組以及糖尿病組的大鼠的尾部靜脈(caudal vein)來收集血液，並依照上面第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量大鼠的血糖濃度。之後，將葡萄糖溶液(劑量為0.5 g/kg)腹腔注射至大鼠體內，並於STZ注射之後的第30、60、90以及120分鐘藉由靜脈穿刺採血而從大鼠的尾部靜脈來收集血液，並依照上面第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量大鼠的血糖濃度。在該4個時間點所分別測得的血糖濃度中，若最高的血糖濃度是大於200 mg/dL，則該大鼠被定義為具有高血糖症，而若最高的血糖濃度是介於150至200 mg/dL之間，則該大鼠被定義為具有葡萄糖恆定不良(impaired glucose homeostasis)。
由實驗結果發現：大多數的正常組大鼠在葡萄糖溶液注射之後的第60、90以及120分鐘所測得的血糖濃度均是低於120 mg/dL，因此屬於正常大鼠。另外，在葡萄糖溶液注射之後的大約第60分鐘，大多數的糖尿病組大鼠的血糖濃度是高於200 mg/dL。
為了進一步判斷帶有STZ－誘發的高血糖症(STZ－induced hyperglycemia)的大鼠是屬於第1型或第2型糖尿病，在完成葡萄糖耐受性試驗之後的第8天，所有帶有STZ－誘發的高血糖症的大鼠被用來進行下面的葡萄糖－胰島素耐受性試驗(glucose－insulin tolerance test)。首先，在經歷15小時的禁食後，藉由靜脈穿刺採血而從帶有STZ－誘發的高血糖症的大鼠的尾部靜脈來收集血液，並且依照上面第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量大鼠的血糖濃度。
之後，將一由葡萄糖(劑量為0.5 g/kg)與胰島素(劑量為0.2 U/kg)所構成的混合物腹腔注射至大鼠體內，並在注射之後的第30、60、90以及120分鐘，藉由靜脈穿刺採血而從大鼠的尾部靜脈來收集血液，並且依照上面第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量大鼠的血糖濃度。
若在該混合物的腹腔注射之後的第60至90分鐘期間，大鼠的血糖濃度回復至該混合物注射之前的數值，或者在該混合物注射之後的大約第90分鐘，大鼠的血糖濃度是低於該混合物注射之前的數值，則表示大鼠具有正常的胰島素調節功能，並將牠分組為“帶有第1型糖尿病的大鼠”。
若在該混合物的腹腔注射之後的第120分鐘，大鼠的血糖濃度是高於該混合物注射之前的數值，則表示大鼠具有胰島素抗性(insulin resistance)，並將牠分組為“帶有第2型糖尿病的大鼠”。
3.統計分析：在下面的實施例中，實驗數據是以平均值±標準偏差(S.D.)來表示(統計顯著性，p<0.05)。所有的數據是藉由鄧肯氏多變域檢定(Duncan’s multiple range test)繼之以變異數分析(analysis of variance,ANOVA)來作分析，俾以評估實驗組與對照組之間的差異性。
實施例1. 粉擬青黴菌G30801的固態發酵培養物(solid fermented culture)對於帶有鏈佐黴素－誘發的第1型或第2型糖尿病的大鼠的血糖位準的影響
實驗方法：1.粉擬青黴菌G30801的固態發酵培養物的製備：分別取300 g的米(rice)、大豆(soybean)以及黑豆(black bean)作為固態基質(solid substrates)(其中大豆與黑豆在使用之前有預先於4℃下以2至3倍體積的水予以浸泡歷時4小時)，並分別予以加入300 mL的含有2%蛋白以及0.1% KH2PO4的溶液，然後於100℃下予以煮熟。煮熟的混合物接而被分別地置放於一個1000 mL的廣口塑膠瓶(wide mouth plastic bottle)中，並於121℃、1.5大氣壓力下進行滅菌歷時30分鐘。當廣口塑膠瓶的溫度降低至室溫時，將10 mL的粉擬青黴菌G30801的菌絲體接種物分別接種至各個廣口塑膠瓶中，然後於17℃下進行發酵歷時20天。之後，所獲得的米發酵培養物(rice fermented culture)、大豆發酵培養物(soybean fermented culture)以及黑豆發酵培養物(black bean fermented culture)被冷凍乾燥(freeze drying)(Model 77500,Labconco)，繼之以研磨(grinding)，而形成發酵培養物粉末(fermented culture powder)。
將所獲得的發酵培養物粉末分別溶於經滅菌的逆滲透水(sterilized reverse osmosis water)中以配製出米發酵培養物溶液、大豆發酵培養物溶液以及黑豆發酵培養物溶液(各自具有一為60 mg/mL的發酵培養物濃度)備用。
2.粉擬青黴菌G30801的固態發酵培養物對於帶有第1型或第2型糖尿病的大鼠的血糖位準的影響：將正常大鼠還有依照上面“B、一般實驗方法”的第2項「第1型或第2型糖尿病的誘發」當中所述的方法而被分組為帶有第1型糖尿病的大鼠以及帶有第2型糖尿病的大鼠(在牠們完成葡萄糖－胰島素耐受性試驗之後的第15天)分別隨機地分成4組(每組n＝5)，其中包括3個實驗組(亦即米發酵培養物組、大豆發酵培養物組以及黑豆發酵培養物組)以及1個對照組。
在經歷15小時的禁食後，藉由靜脈穿刺採血而從各組大鼠的尾部靜脈來收集血液，並且依照上面“B、一般實驗方法”的第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量血糖濃度，俾以確定帶有第1型或第2型糖尿病的大鼠具有高血糖症，而正常大鼠具有正常的血糖位準。之後，米發酵培養物組、大豆發酵培養物組以及黑豆發酵培養物組的大鼠分別被餵食以前面所製得的米發酵培養物溶液、大豆發酵培養物溶液以及黑豆發酵培養物溶液(各組的劑量皆為60 mg/kg)，而對照組大鼠被餵食以經滅菌的逆滲透水(1 mL/kg)。接著，藉由靜脈穿刺採血而從大鼠的尾部靜脈來收集血液，並且依照上面“B、一般實驗方法”的第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量血糖濃度，俾以再次確定帶有第1型或第2型糖尿病的大鼠具有高血糖症，而正常大鼠具有正常的血糖位準。
在餵食之後的第30分鐘，將葡萄糖溶液(劑量為0.5 g/kg)腹腔注射至各組大鼠體內，並在注射之後的第0、30、60、90以及120分鐘，藉由靜脈穿刺採血而從大鼠的尾部靜脈來收集血液，並且依照上面“B、一般實驗方法”的第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量大鼠的血糖濃度。在葡萄糖溶液的腹腔注射之後，大鼠的血糖濃度隨著時間的改變量(the variation of the blood glucose concentration of rat by time)(mg/dL)是以在葡萄糖溶液的腹腔注射之後的第30、60、90或120分鐘所測得的血糖濃度與第0分鐘所測得者的差值來表示。最後，依照上面“B、一般實驗方法”的第3項「統計分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果：圖1至圖3分別顯示正常大鼠、帶有第1型糖尿病的大鼠以及帶有第2型糖尿病的大鼠在分別被餵食以本發明的粉擬青黴菌G30801的米發酵培養物、大豆發酵培養物、黑豆發酵培養物以及經滅菌的逆滲透水，繼而被腹腔注射以葡萄糖溶液之後，牠們的血糖濃度隨著時間的改變量。
參見圖1，對於正常大鼠，在葡萄糖溶液的腹腔注射之後，米發酵培養物組、大豆發酵培養物組以及黑豆發酵培養物組的血糖濃度隨著時間的改變量相較於對照組所具者並沒有顯著的差異，而且牠們的血糖濃度均在正常的範圍(80－120 mg/dL)內。這個結果顯示：依據本發明的粉擬青黴菌G30801的米發酵培養物、大豆發酵培養物以及黑豆發酵培養物不會影響正常大鼠的血糖位準。
參見圖2，對於帶有第1型糖尿病的大鼠，在葡萄糖溶液的腹腔注射之後，米發酵培養物組、大豆發酵培養物組以及黑豆發酵培養物組的血糖濃度隨著時間的改變量相較於對照組所具者都有降低，其中米發酵培養物組的血糖濃度改變量是最低的。這個結果顯示：依據本發明的粉擬青黴菌G30801的米發酵培養物、大豆發酵培養物以及黑豆發酵培養物對於帶有第1型糖尿病的大鼠皆具有降低血糖位準的效用，並且米發酵培養物的效果最優。
參見圖3，對於帶有第2型糖尿病的大鼠，在葡萄糖溶液的腹腔注射之後，米發酵培養物組、大豆發酵培養物組以及黑豆發酵培養物組的血糖濃度隨著時間的改變量相較於對照組所具者都有顯著的降低，其中米發酵培養物組的血糖濃度改變量是最低的。這個結果顯示：依據本發明的粉擬青黴菌G30801的米發酵培養物、大豆發酵培養物以及黑豆發酵培養物對於帶有第2型糖尿病的大鼠皆具有降低血糖位準的效用，並且米發酵培養物的效果最優。
實施例2. 粉擬青黴菌G30801的液態發酵培養物(liquid fermented culture)對於帶有鏈佐黴素－誘發的第1型或第2型糖尿病的大鼠的血糖位準的影響
實驗方法：1.粉擬青黴菌G30801的液態發酵培養物的製備：本實施例使用具有下列表1所示配方的液態培養基。
將3 L的液態培養基加入至一為5 L的發酵槽(fermentation tank)(Marubishi,Bioneer 500－5L)中，然後於121℃、1.5大氣壓力下進行滅菌歷時30分鐘。當發酵槽的溫度降低至17℃時，將100 mL的粉擬青黴菌G30801菌絲體接種物接種至發酵槽中，然後使該發酵槽在一為17℃的溫度以及一為110 rpm的攪拌速率下進行發酵歷時7天，之後收集所獲得的液態發酵培養物，並以3,000 rpm(Model CF16RX,Hitachi)來進行離心歷時15分鐘，而得到一菌絲體產物(mycelium product)以及一澄清的發酵液產物(fermented liquid product)。該菌絲體產物被冷凍乾燥(Model 77500,Labconco)，繼之以研磨，而形成菌絲體產物粉末。將該菌絲體產物粉末溶於經滅菌的逆滲透水中以配製成具有一濃度為60 mg/mL的菌絲體產物溶液備用。
2.粉擬青黴菌G30801的液態發酵培養物對於帶有第1型或第2型糖尿病的大鼠的血糖位準的影響：在本實施例中，商業上可購得的降血糖藥物(hypoglycemic drugs)，包括滅糖尿(Minidiab)(PHARMACIA)與迪化糖(Diaformin)(Alphapharm)被用來作為陽性對照(positive control)，並與依據本發明的粉擬青黴菌G30801的液態發酵培養物(亦即菌絲體產物與發酵液產物)進行相同的實驗。
將依照上面“B、一般實驗方法”的第2項「第1型或第2型糖尿病的誘發」當中所述的方法而被分組為帶有第1型糖尿病的大鼠以及帶有第2型糖尿病的大鼠(在牠們完成葡萄糖－胰島素耐受性試驗之後的第15天)分別隨機地分成5組(每組n＝5)，其中包括4個實驗組(亦即菌絲體產物組、發酵液產物組、滅糖尿組與迪化糖組)以及1個對照組。
在經歷15小時的禁食後，藉由靜脈穿刺採血而從各組大鼠的尾部靜脈來收集血液，並且依照上面“B、一般實驗方法”的第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量血糖濃度，俾以確定帶有第1型或第2型糖尿病的大鼠具有高血糖症。之後，菌絲體產物組、發酵液產物組、滅糖尿組以及迪化糖組的大鼠分別被餵食以前面所製得的菌絲體產物溶液(劑量為60 mg/kg)、發酵液產物(劑量為4 mL/kg)、滅糖尿(劑量為800 mg/kg)以及迪化糖(劑量為1500 mg/kg)，而對照組大鼠被餵食以經滅菌的逆滲透水(1 mL/kg)。接著，藉由靜脈穿刺採血而從大鼠的尾部靜脈來收集血液，並且依照上面“B、一般實驗方法”的第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量血糖濃度，俾以再次確定帶有第1型或第2型糖尿病的大鼠具有高血糖症。
在餵食之後的第30分鐘，將葡萄糖溶液(劑量為0.5 g/kg)腹腔注射至各組大鼠體內，並在注射之後的第0、30、60、90以及120分鐘，藉由靜脈穿刺採血而從大鼠的尾部靜脈來收集血液，而且依照上面“B、一般實驗方法”的第1項「血糖濃度分析」當中所述的方法來測量大鼠的血糖濃度。在葡萄糖溶液的腹腔注射之後，大鼠的血糖濃度隨著時間的改變量(mg/dL)是以在葡萄糖溶液的腹腔注射之後的第30、60、90或120分鐘所測得的血糖濃度與第0分鐘所測得者的差值來表示。最後，依照上面“B、一般實驗方法”的第3項「統計分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。
結果：圖4與圖5分別顯示帶有第1型糖尿病的大鼠與帶有第2型糖尿病的大鼠在分別被餵食以本發明的粉擬青黴菌G30801的液態發酵培養物(亦即菌絲體產物與發酵液產物)、滅糖尿、迪化糖以及經滅菌的逆滲透水，繼而被腹腔注射以葡萄糖溶液之後，牠們的血糖濃度隨著時間的改變量。
參見圖4，對於帶有第1型糖尿病的大鼠，在葡萄糖溶液的腹腔注射之後，菌絲體產物組、發酵液產物組、滅糖尿組以及迪化糖組的大鼠的血糖濃度隨著時間的改變量相較於對照組所具者都有降低。這個結果顯示：依據本發明的粉擬青黴菌G30801的菌絲體產物以及發酵液產物對於帶有第1型糖尿病的大鼠皆具有降低血糖位準的效用。
參見圖5，對於帶有第2型糖尿病的大鼠，在葡萄糖溶液的腹腔注射之後，菌絲體產物組、發酵液產物組、滅糖尿組以及迪化糖組的大鼠的血糖濃度隨著時間的改變量相較於對照組所具者都有顯著的降低，其中發酵液產物組的血糖濃度改變量是最低的。另外，菌絲體產物組的血糖濃度改變量是介於滅糖尿組與迪化糖組所具者之間。這個結果顯示：依據本發明的粉擬青黴菌G30801的菌絲體產物以及發酵液產物對於帶有第2型糖尿病的大鼠皆具有降低血糖位準的效用，特別是該發酵液產物。
於本案說明書中被引述之所有文獻資料以及專利文件以它們的整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案的詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
【圖式簡單說明】圖1顯示正常大鼠在被餵食以粉擬青黴菌G30801的米發酵培養物、大豆發酵培養物以及黑豆發酵培養物，繼而被腹腔注射以葡萄糖溶液之後，牠們的血糖濃度隨著時間的改變量，其中被餵食以經滅菌的逆滲透水的正常大鼠被用作為對照組；圖2顯示帶有第1型糖尿病的大鼠在被餵食以粉擬青黴菌G30801的米發酵培養物、大豆發酵培養物以及黑豆發酵培養物，繼而被腹腔注射以葡萄糖溶液之後，牠們的血糖濃度隨著時間的改變量，其中被餵食以經滅菌的逆滲透水的帶有第1型糖尿病的大鼠被用作為對照組，以及“＊”表示p<0.05；圖3顯示帶有第2型糖尿病的大鼠在被餵食以粉擬青黴菌G30801的米發酵培養物、大豆發酵培養物以及黑豆發酵培養物，繼而被腹腔注射以葡萄糖溶液之後，牠們的血糖濃度隨著時間的改變量，其中被餵食以經滅菌的逆滲透水的帶有第2型糖尿病的大鼠被用作為對照組，以及“＊”表示p<0.05；圖4顯示帶有第1型糖尿病的大鼠在被餵食以粉擬青黴菌G30801的液態發酵培養物(亦即菌絲體產物與發酵液產物)、滅糖尿以及迪化糖，繼而被腹腔注射以葡萄糖溶液之後，牠們的血糖濃度隨著時間的改變量，其中被餵食以經滅菌的逆滲透水的帶有第1型糖尿病的大鼠被用作為對照組，以及“＊”表示p<0.05；以及
圖5顯示帶有第2型糖尿病的大鼠在被餵食以粉擬青黴菌G30801的液態發酵培養物(亦即菌絲體產物與發酵液產物)、滅糖尿以及迪化糖，繼而被腹腔注射以葡萄糖溶液之後，牠們的血糖濃度隨著時間的改變量，其中被餵食以經滅菌的逆滲透水的帶有第2型糖尿病的大鼠被用作為對照組，以及“＊”表示p<0.05。